一種miRNA標記物、其方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，涉及一種用于預測、診斷和/或評價食管磯狀細胞癌 患者對放化療是否存在響應的標記物及其應用，尤其涉及使用兩種在人血清中穩定存在且 可檢測的微小核糖核酸成熟體作為預測、診斷和/或評價食管磯狀細胞癌患者對放化療是 否存在響應的標記物。進一步地，本發明還提供了用于檢測所述標記物的探針組合、試劑盒 和生物芯片W及所述標記物的應用，具體地，通過檢測受試者血清中所述標記物的表達水 平和變化，來判斷食管磯狀細胞癌患者是對放化療是否存在響應。
【背景技術】
[0002] 食管癌是一種具有不良預后的致命惡性腫瘤，其中食管鱗狀細胞癌巧SCC)是一 種具有鱗狀細胞分化的惡性上皮性腫瘤，其顯微鏡下特點表現為角質細胞樣細胞之間存在 細胞間橋，或伴有角化。
[0003] 食管鱗狀細胞癌在發生率、死亡率和性別比率上均顯示了極大的地域差異。在西 方國家的大部分地區，鱗狀細胞癌每年的標準年齡發病率，男性為< 5人/10億，女性< 1 人/10萬。在一些高危地區，比如法國西北部的諾曼底和卡己度思W及意大利北部，發病率 高達30人/10萬，女性為2人/10萬。送種癌在東方國家及許多發展中國家發病率更高。 目前已經確認的高發區有伊朗、中國中部、南非W及己西南部。在中國河南省省會鄭州市， 男性死亡率> 100人/10萬，女性> 50人/10萬。無論在高危還是低危地區，送種癌極少 發生在30歲W下患者，男性及女性發病的平均年齡為65歲。在中國，食管鱗狀細胞癌是最 常見的食管癌類型。
[0004] 手術仍然是送種癌癥的主要治療手段，然而，ESCC的預后不良。根據文獻記錄。 長期預后率較低，五年生存率約為30%。早期發現的淺表性癌可W治愈。生存率依賴于W 下幾個方面，包括腫瘤診斷時的分期、所接受的治療、患者的一般身體狀況、腫瘤的形態學 特點W及分子學特點。過去對于預后指標的研究大部分都集中在郝些接受過外科手術的患 者，極少研究接受過放化療或多方式治療的患者。
[0005]為了改善送種癌癥的治療效果，當前已經將術前放化療并入治療計劃。送種術前 放化療確實導致更好的結果，增加了治愈的機會。不幸的是，對于不存在響應的患者可能不 得不經受長時間、不必要的和有潛在毒性的治療，而不能獲得益處。然而，對于患者是否對 放化療存在響應，當前還沒有開發出可靠的預測方法。因此，迫切需要一種方法，用來區分 對放化療有響應的患者和對放化療沒有響應的患者。
[0006] 微小核糖核酸（microRNA，簡寫作miRNA)是一類長約19至23個核巧酸的非編碼 單鏈小核糖核酸分子。它們在進化上高度保守，廣泛存在于動植物細胞中。近五年來在人 類、小鼠、大鼠等多種生物物種中鑒別出數百種微小核糖核酸分子。
[0007] 微小核糖核酸通過識別祀mRNA的3'端非翻譯序列，與之不完全互補，從而抑制祀 mRNA的翻譯，是mRNA強有力的調節因子，并在基因表達調控領域中起重要作用。
[0008] 微小核糖核酸與動物的許多正常生理活動密切相關，與許多疾病的發生及發展存 在密切聯系。微小核糖核酸完全可w作為一類新的疾病標志物，相比于傳統的病理切片或 單一使用的生化指標等手段，能更加準確地輔助診斷疾病，判斷疾病的發展階段，預測并發 癥發生和惡性疾病復發的幾率，W及疾病的預后，并評價藥效和療效。
[0009] 微小核糖核酸在作為疾病標志物方面的優勢，使其成為近年研究的熱點，相關技 術及產品也相繼涌現。
【發明內容】
[0010] 為了滿足上述需求，本申請發明人在尋找用于預測、診斷和/或評價食管磯狀細 胞癌患者對放化療是否存在響應的標記物時，將研究目光投向較易獲得，甚至常規體檢中 就可W收集到的血液中的微小核糖核酸。由于血液會循環至全身所有組織，并向細胞輸送 營養并清除廢物，因此血液更能夠反映出整個機體的生理、病理狀況。在此基礎上，發明人 繼續研究，并對標記物的種類進行了篩選和優化，最終獲得的可解決所述的技術問題的標 記物的種類大大減少，相應的探針庫也得到極大簡化，同時還能實現高診斷準確率。
[0011] 因此，本發明的目的是一種miRNA標記物，該標記物可W用于預測、診斷和/或評 價食管磯狀細胞癌患者對放化療是否存在響應。
[0012] 本發明的另一個目的是提供一種用于預測、診斷和/或評價食管磯狀細胞癌患者 對放化療是否存在響應的探針組合。
[0013] 本發明的又一個目的是提供一種檢測miRNA標記物的方法。
[0014] 本發明的另一個目的是提供上述標記物的用途，包括制備相應的試劑盒和生物芯 片。
[0015] 本發明的再一個目的是提供使用上述標記物預測、診斷和/或評價受試者對放化 療是否存在響應的方法。
[0016] 本發明的目的是采用W下技術方案來實現的。
[0017] 一方面，本發明提供一種用于預測、診斷和/或評價食管磯狀細胞癌患者對放化 療是否存在響應的標記物，所述標記物為miRNA-16和/或miRNA-193b。
[0018] 另一方面，本發明提供了一種檢測上述標記物的方法，所述方法選自反轉錄聚合 酶鏈式反應方法（RT-PCR)、實時英光定量聚合酶鏈式反應方法巧ea^time PCR)、微滴式數 字PCR方法值roplet Digital PCR)、No;rthe;rn印跡雜交方法（No;rthe;rn blotting)、核糖 核酸酶保護分析方法（RNase protection assay)、Solexa測序技術（Solexa sequencing technology)、生物芯片方法和新一代測序方法（Next Generation Sequencing)中的一種 或幾種。
[0019] 優選地，所述方法為RT-PCR方法，例如包括W下步驟的RT-PCR方法：
[0020] 1)提取受試者的血清總RNA，通過RNA逆轉錄反應得到cDNA樣品；或者收集受試 者的血清樣本，W血清作為緩沖液進行逆轉錄反應來制備cDNA樣品；
[002。 2)用微小核糖核酸設計引物進行PCR反應；
[002引 3)進行PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳；
[0023] 4化B染色后在紫外燈下觀察結果；
[0024] 或者優選地，所述方法為Real-time PCR方法，例如包括W下步驟的Real-time PCR方法：
[00巧]1)提取受試者的血清總RNA，通過RNA逆轉錄反應得到cDNA樣品；或者收集受試 者的血清樣本，W血清作為緩沖液進行逆轉錄反應來制備cDNA樣品；
[0026] 2)用微小核糖核酸設計引物；
[0027] 3)加入英光探針進行PCR反應；
[0028] 4)檢測并比較血清樣本相對于正常血清中微小核糖核酸的量的變化。
[0029] 或者優選地，所述方法為化opletDigitalPCR方法，例如包括如下步驟的 DropletDigitalPCR方法：
[0030] 1)提取受試者的血清總RNA，通過RNA逆轉錄反應得到cDNA樣品；或者收集受試 者的血清樣本，W血清作為緩沖液進行逆轉錄反應來制備cDNA樣品；
[0031] 2)對樣品進行微滴化處理；
[0032] 3)用微小核糖核酸設計引物；
[003引4)加入英光探針進行PCR反應；
[0034] 5)檢測并比較血清樣本相對于正常血清中微小核糖核酸的量的變化。
[0035] 或者優選地，所述方法為RT-qPCR方法，例如包括如下步驟的RT-qPCR方法：
[0036] 1)提取受試者的血清總RNA，通過RNA逆轉錄反應得到cDNA樣品；或者收集受試 者的血清樣本，W血清作為緩沖液進行逆轉錄反應來制備cDNA樣品；
[0037] 2)對樣品進行預擴增；
[0038] 優選地，所述預擴增包括W下步驟：
[0039]a)配制含除cDNA和引物W外試劑的預擴增PCR體系母液，份數依逆轉錄得到的 cDNA的份數來定；
[0040]b)取母液混合物放入PCR反應管中，加入對應的引物（包含正向引物、反向引物） 及逆轉的cDNA，組成20μ1的反應體系，混合均勻。
[0041]C)將20μ1的混合物進行PCR預擴增；
[0042] 優選地，所述擴增條件為95°ClOmin，一個循環；95°C15s，60°CImin，12個循環；
[004引3)qRT-PCR反應，并對待測的miRNA進行定量；
[0044] 優選地，所述RT-qPCR方法中，使用ΔCT法處理數據，其中每個miRNA相對于標準 內參的表達量用方程2AET表示，ACT=CT樣品-CT內參。
[0045] 具體來說，本發明提供的檢測受試者血清中的上述標記物的方法，可W進一步評 價患者對放化療是否存在響應。所述檢測人體血清中穩定存在且可檢測的上述標記物 的方法包括：反轉錄聚合酶鏈式反應方法（RT-PCR)、實時英光定量聚合酶鏈式反應方法 (Real-timePCR)、微滴式數字PCR方法值ropletDigitalPCR)、No;rthe;rn印跡雜交方 法（No;rthe;rnblotting)、核糖核酸酶保護分析方