一株表達木糖異構酶的釀酒酵母菌株及構建方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種酵母菌株，具體設及的是一株表達木糖異構酶的釀酒酵母菌株W 及該菌株的構建方法。
【背景技術】
[0002] 近年來，燃料乙醇作為一種最具發展前景的清潔能源受到廣泛關注。W農林廢棄 物為原料的木質纖維素具有來源廣泛、儲量大、價格低廉、可再生等優點而被視為燃料乙醇 生產的理想原料。釀酒酵母巧rcescereKisiae)因具有糖酵解速率快，乙醇產量 高，對環境耐受能力好等優點，是工業乙醇生產過程最常用的微生物。然而，在木質纖維素 水解獲得的糖液中，約有20% - 30%的糖為木糖，是野生型釀酒酵母不能直接利用木糖進行 生長和發酵，但釀酒酵母體內存在木酬糖激酶（X^ulose kinase, XK)，能將木酬糖憐酸化 生成木酬糖-5-憐酸，然后進入戊糖憐酸途徑（Pentose Phosphate Pathway, PPF0參與酵 母的代謝。因此只要成功的溝通木糖轉到木酬糖的橋梁，就能構建出能同時發酵木糖產乙 醇的工程菌株。
[0003]自然界中存在兩條木糖代謝途徑，在大多數能利用木糖的真菌和酵母中，木糖可 被NADPH依賴型木糖還原酶狂^osere化ctase，XR)還原為木糖醇，然后被NAD+依賴型 木糖醇脫氨酶a^itoldehy化ogenase,XDH)氧化為木酬糖，再憐酸化進入PPP途徑。然 而，XR主要為NADPH依賴型酶，而XDH則是嚴格的NAD+依賴型酶，不同的輔酶親和性導致體 內的輔酶不平衡問題，從而使菌株大量積累中間代謝產物木糖醇，大大降低了乙醇的產量。
[0004] 在一些細菌和厭氧真菌中，存在木糖異構酶狂^oseisomerase,XI)基因巧r_Z4， 可直接將木糖異構化生成木酬糖，然后憐酸化進入ppp途徑。理論上講，如果XI途徑能夠 成功的在釀酒酵母中進行表達，則可W避免木糖醇的生成，從而提高乙醇的產量。但從相關 報道來看，雖然基因在釀酒酵母中異源表達后能產生相應的活性蛋白，但所構建的重 組菌在木糖中的生長速率均比較緩慢，不能滿足發酵的需求。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于解決現有基因在釀酒酵母中異源表達后，其構建的重組 菌在木糖中的生長速率均比較緩慢，不能滿足發酵需求的問題；提供解決上述問題的一株 基于木糖異構酶途徑的且能夠高效發酵木糖產乙醇的工業釀酒酵母。
[0006] 為達到上述目的，本發明的技術方案如下： 一株表達木糖異構酶的釀酒酵母菌株，所述釀酒酵母cereKisiae SEB7)菌株保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中屯、，保藏號為CGMCC11327,保藏時間為 2015年9月6日。
[0007]本發明首次使用具有木糖代謝背景的絮凝性工業酵母作為出發菌株，來構建基于 XI途徑可發酵木糖菌株。即將源自普雷沃氏菌（化ewieiiariwinic〇ya)TC2-24的木糖異 構酶（巧loseisomerase,XI)基因進行密碼子優化，將其氨基酸密碼子優化為 釀酒酵母偏好型密碼子；將優化后的XI的編碼基因身?接入酵母多拷貝質粒PRS426 上，導入絮凝性工業釀酒酵母YC-8中，然后利用兩段式進化工程提升菌株在木糖培養基上 的生長及發酵速率，進而獲得高生長速率、且能高效發酵木糖產乙醇的釀酒酵母SEB7。
[0008] 通過實驗驗證發現：本發明得到的菌株SEB7的木糖代謝速率達到1. 70 + 0. 04g/ g-DCW/h，乙醇收率達到0. 412 + 0. 009g/g-木糖，即該菌株SEB7的木糖代謝速率和乙醇收 率均高于大部分國內外的報道。其中，DCW代表細胞干重。
[0009] 如權利要求1所述釀酒酵母菌株的構建方法，包括W下步驟： 1)構建出發菌株：將釀酒酵母SEB3進行產抱子后，篩選出單倍體菌株SEB3α25,利用 同源重組的方法將單倍體菌株SEB3a25中的間沁?-ZfZy-Z化么片段進行敲除，再W履打必r 為篩選標記，將單倍體菌株SEB3α25的β?庶疆因進行敲除，得到出發菌株YC-8。
[0010] 2)構建表達載體：獲得如SEQIDNO:1所示的心基因，然后通過酶切、 連接的方法將盛因連接在酵母多拷貝質粒PRS426中，構建出多拷貝表達載體 PRS426-PXYLA2 ； 所述盛因的獲得過程如下：將源自于普雷沃氏菌TC2-24的木糖異構酶基因 通過密碼子優化后獲得適合在釀酒酵母中進行表達的心基因。
[0011] 3)將多拷貝表達載體PRS426-PXYLA2通過醋酸裡法導入酵母菌株YC-8中，構建出 工業釀酒酵母YCPA2; 4)利用兩段式進化工程（有氧生長馴化和微氧發酵馴化）對菌株YCPA2進行馴化后獲 得菌株SEB7。
[0012] 所述有氧生長馴化過程如下：按起始〇〇?3。=〇. 05的接種量，將菌株YCPA2接入 含100血2%的ΥΝΒΧ培養基中，30 °C下180巧m轉速搖床培養到細胞生長對數期，再按 0Dee"=0. 05接種量轉接入新的培養基，如此反復培養轉接，共馴化28天； 所述微氧發酵馴化過程如下：有氧生長馴化結束后，將菌株按起始〇Dee"=〇. 05的接種 量，接入含100mL2%的YNBX培養基中，于水浴鍋中30°C、200巧m的條件下培養，待菌株生 長到對數期時，將菌株按起始〇Deea=〇. 05的接種量轉接入新的培養基，如此反復培養轉接， 馴化24天后得到SEB7菌株； 所述2%YNBX培養基主要由1.7g/L無氨基酵母氮源、10g/L硫酸錠、20g/L木糖構 成。
[0013] 本發明與現有技術相比，具有W下優點及有益效果： 1、 本發明首次使用具有木糖代謝背景的絮凝性工業酵母作為出發菌株，來構建基于XI 途徑可發酵木糖菌株； 2、 本發明得到的菌株SEB7在48h的發酵時間里，能夠利用16. 95g/L木糖，產生6. 98 g/L的乙醇，乙醇收率達到0. 412g/g木糖；該菌株具有木糖發酵快、乙醇收率高等優點。 本發明中設及保藏的微生物的保藏信息如下： 保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、；地址：北京市朝陽區北 辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所；保藏日期：2015年9月6日；保藏編號： CGMCC11327、CGMCC11323;分類命名：Saccharomycescerevisiae。
【具體實施方式】
[0014] 下面結合實施例，對本發明作進一步地詳細說明，但本發明的實施方式不限于此。
[001引 實施例1 一株表達木糖異構酶的釀酒酵母菌株，所述釀酒酵母cereKisiae SEB7)菌株保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中屯、，保藏號為CGMCC11327。該釀酒酵母 菌株SEB7的具體構建方法如下： 1)構建出發菌株： 將釀酒酵母SEB3在產抱子培養基（0.5g/L葡萄糖，20g/L醋酸鐘，2g/L酵母粉，pH 5. 5)上培養2天后，利用溶壁酶30°C下處理10-20min后，于四抱子分析儀上挑取單抱 子，經驗證后獲得單倍體細胞。本發明只選擇性別為α的單倍體，最終篩選出單倍體菌株 沈Β3α25。
[001引 W質粒地lu-LTKTl-TD冊為模板，利用引物Fg3/Rg3擴增出知X尸-尿Miff-知X尸片 段，然后利用醋酸裡法導入菌株SEB3α25中，利用同源重組的方式，W尿為篩選標記， 將知足anifJ-知X/巧段導入菌株的ex'化?位點上，敲除β?庶疆因，使菌株失去木糖醇生成 能力，基因敲除與否利用引物Fg-v/Rg-v進行驗證。
[0017] 利用同樣原理，W質粒地lu-LTK化-TD冊為模板，利用引物Fxy/R巧擴增出 7ox尸-足anifJ-知X/巧段，利用同源重組的方式，WG如貨％篩選標記，將知足anifJ-知X尸 片段導入菌株的挪A?位點上，將SEB3α25中的挪化y-Zf以基因敲除，使菌株失去 木糖利用能力，利用5-氣乳清酸巧-F0A)平板（1.7g/L無氨基酸酵母氮源，5.0g/L (NH4)2S04,20g/L葡萄糖，50mg/L尿喀晚，1.0g/L5-F0A)驗證娜43基因的敲除，同時利 用引物XYL1-F/XYL1-R驗證XYL1的敲除情況，利用XYL2-F/XYL2-R驗證XYL2基因的敲除 情況，最后得到出發菌株YC-8。
[0018] 本發明中盛因和基因敲除的先后順序可W調換。
[0019] 上述釀酒酵母SEB3保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中屯、，保藏編號為 CGMCC11323。質粒地lu-LTK化-I'D冊為現有質粒，記載在下述文獻中：Tomitaka,M.， Taguchi,比，Fukuda,Κ.，Akamatsu,Τ.，Kida,Κ.，Isolationandcharacterization ofamutantrecombinantSaccharomycescerevisiaestrainwithhighefficiency x)doseutilization,J.Biosci.Bioeng·，2013，116，706 - 715.該文獻翻譯后名稱 為：分離及鑒定一株經突變和重組的能高效利用木糖的釀酒酵母。上述利用同源重組的方 式，W足anifl為篩選標記、W及WG如貨％篩選標記進行位點基因敲除的方法為本行業常規 技術手段，因此在此不再寶述。
[0020] 2)構建表達載體： 2. 1)將源自于Cruwinico知TC2-24的木糖異構酶原始基因序列巧了以7的密碼子進 行釀酒酵母偏好型優化，獲得如SEQIDNO: 1所示的因。
[0021] 2. 2)W質粒pXR為模板，利用引物T7-F及TD冊t-R擴增Τ?3基因片段，引物T7-F 及TD冊t-R上分別帶有酶切位點描〇1和&刀，PRS426質粒經描〇1和&刀雙酶切后，利用 T4連接酶將T?d3連接入經雙酶切的PRS426質粒上，形成PRS426-Tτ?Η3。
[0022] 質粒pXR為現有質粒，與質粒地lu-LTK化-I'D冊一起被公開在上述文獻中。
[002引 2. 3 )W質粒pXR為模板，利用引物TD冊P-F及T3-R擴增P?d3基因片段，引物 TD冊P-F及T3-R上分別帶有酶切位點化細創和Abd，pRS426質粒經化細創和Abd雙酶切 后，利用Τ4連接酶將P?3連接入經雙酶切的PRS426質粒上，形成PRS426-PτηΗ3-Τπ?3。
[0024] 2. 4)分別利用引物PXYLA1-F/PXYLA1-R和PXYLA2-F/PXYLA2-R將巧72心基因擴 增出來，將伴化心基因片段及質粒PRS426-P 經仍〇姐酶切后，用Τ4連接酶連接， 經酶切、測序驗證后，即獲得多拷貝表達載體PRS426-PXYLA2。
[00巧]3)利用醋酸裡法將多拷貝表達載體PRS426-PXYLA2導入酵母菌株YC-8中，利用 2%ΥΝΒΧ平板篩選出陽性轉化子，即為木糖利用菌株，命名為工業釀酒酵母YCPA2。本