一株耐酸絮凝性工業釀酒酵母菌株及構建方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種酵母菌株，具體設及的是一株耐酸絮凝性工業釀酒酵母菌株W及 該菌株的構建方法。
【背景技術】
[0002] 生物燃料乙醇被認為是可替代傳統燃油的重要能源。釀酒酵母是生物乙醇工業生 產中主要使用的微生物，一般菌株的最適抑值為4-5。當抑高于或低于該范圍時，菌株的 生長和發酵能力下降。而大規模工業化生產需要很好的控制雜菌污染，盡量降低發酵體系 的抑值是比較有效的措施。此外，木質纖維素類生物質是重要的燃料乙醇生產原料，對其 利用的首要步驟需采用稀酸進行預處理，由此產生的水解液抑值較低，需要調節至合適的 pH值后才能用于酵母的乙醇發酵。因此，獲取耐受低抑值的優良酵母菌株有助于提高乙醇 生產的穩定性，降低生產成本。
[0003] 原生質體融合是一種常用的微生物育種技術，指通過人為的方法，使遺傳性狀不 同的兩個細胞的原生質體進行融合，借W獲得兼有雙親遺傳性狀的穩定重組子的過程。與 其他育種技術相比，原生質體融合技術具有重組頻率較高、受接合型或致育型限制較小和 遺傳物質更為完整等優勢，因而被國內外微生物育種學者廣泛應用。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于解決現有融合技術融合出的菌株大多只能有效兼有雙親遺傳 性狀，而不能有效提高融合后菌株遺傳性狀性能的問題；提供一株既能有效兼有雙親遺傳 性狀、同時還能在乙醇產量、葡萄糖消耗量及消耗速率上均優于親本菌株的耐酸絮凝性工 業釀酒酵母菌株，并提供了該菌株的構建方法。
[0005] 為達到上述目的，本發明的具體技術方案如下： 一株耐酸絮凝性工業釀酒酵母菌株，所述釀酒酵母（&CC皮cereWsiaeS邸4)菌株保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中屯、，保藏號為CGMCC11324， 時間為2105年9月6日。
[0006] 本發明中融合后的釀酒酵母SEB4菌株，不僅兼有雙親遺傳性狀，即具有親本融合 子RHZ-1良好的絮凝性和發酵能力，和親本SEB2良好的耐酸能力；而且其在乙醇產量、葡萄 糖消耗量及消耗速率上均優于親本菌株。
[0007] 經過實驗證明，在30。C、抑2. 2、入糖濃度為150 條件下： 24h時，釀酒酵母SEB4菌株糖消耗量為78. 7%、糖消耗速率為4. 9g/1/h、乙醇產量 為47. 87g/1，親本融合子RHZ-1糖消耗量為64. 9%、糖消耗速率為4. 1g/1/h、乙醇產量為 35. 93g/1，親本SEB2糖消耗量為71. 6%、糖消耗速率為4. 5g/1/h、乙醇產量為32. 69g/ 1 ; 48h時，所有菌株均可將葡萄糖全部消耗，釀酒酵母SEB4菌株乙醇產量為57.76g/1， 親本融合子RHZ-1乙醇產量為51. 93g/1，親本SEB2乙醇產量為54. 42g/1。
[0008] 如權利要求1所述釀酒酵母菌株的構建方法，包括W下步驟： 1) 營養缺陷型突變菌的構建 1. 1)W釀酒酵母 cereKisiaeIR-2 和釀酒酵母 cereKisiaeSEB1為親本，通過細胞融合方式得到融合子RHZ-1 ; 其中，SEB1菌株，具有乙醇生產能力，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中屯、，保藏 編號為CGMCC11321。IR-2菌株：分離自印度尼西亞發酵食品中，具有乙醇生產能力，有絮凝 性，來源記載在下述文獻中：HiroshiK,化shioS,ToshioM,HarumiK,Yo;r;LkazuS. 1985.Continuousethanolfermentationwithcellrecyclingusingflocculating yeast.J.化rment.Technol. 63:159-165;該文獻翻譯后的名稱為：使用絮凝性酵母進 行帶細胞循環的連續乙醇發酵；上述IR-2生物材料從日本產業技術綜合研究所（化tional InstituteofAdvancedIndustrialScienceandTechnology,AIST)獲得。上述IR-2 菌株和SEBl菌株的融合方法如下： SEBl和IR-2在產抱子培養基（0. 5%醋酸裡，2%瓊脂）上生長3天，所得的子囊經酵母 裂解酶處理得到抱子，經甲基橫酸乙醋（EM巧處理2小時，超聲分散后涂到YTO平板培養， 然后影印至最小營養平板上生長4天，檢驗在最小營養平板上不生長的菌落的營養缺陷 型。從SEB1得到異亮氨酸和鄉氨酸缺陷型的菌株SIV-2,從IR-2得到賴氨酸缺陷型的菌株 比-1。
[0009] 上述YTO平板的構成為：2%葡萄糖，1%酵母粉，2%多聚蛋白腺，2%瓊脂，其余為蒸 饋水；上述最小營養平板的構成為：2%葡萄糖，0. 67%無氨基酸酵母氮源，2%瓊脂，其余為蒸 饋水。
[0010] SIV-2和比-1經酵母裂解酶處理2小時后，得到的原生質體在30%的陽G6000中 混勻處理15分鐘，涂到再生平板和選擇平板上。在選擇平板上生長的菌落視為融合子，融 合子數量與再生原生質的數量比值為融合效率。共獲得8株融合子RHZ-1 (融合效率為 1.IX10 5)，篩選獲得利用25%糖蜜發酵產乙醇最快（1. 3g/1/h)和乙醇濃度最高化5g^) 的融合子RHZ-1。
[0011] 上述再生平板的構成為：2%葡萄糖，0. 5%酵母粉，1%多聚蛋白腺，4. 5%氯化鐘，2% 瓊脂，其余為蒸饋水；上述選擇平板的構成為：2%葡萄糖，0. 67%無氨基酸酵母氮源，2%瓊 月旨，其余為蒸饋水。
[0012] 1. 2)將融合子冊Z-1和SEB2進行紫外誘變，分別篩選出融合子冊Z-1和SEB2 的單種營養缺陷型突變菌；SEB2保藏在中國普通微生物菌種保藏管理中屯、，保藏編號為 CGMCC11322。
[0013] 1.3)從融合子RHZ-1單種營養缺陷型突變菌中篩選出絮凝性良好的菌株，并對該 菌株進行生長能力和發酵性能評價實驗，挑選出發酵性能最優的菌株作為后續原生質體融 合的營養缺陷型突變菌KFU;對SEB2單種營養缺陷型突變菌進行生長能力和發酵性能評價 實驗，篩選出性能最優的菌株作為后續原生質體融合的營養缺陷型突變菌KAG0U; 2) 原生質體融合菌株的構建 2. 1)W營養缺陷型突變菌KRJ和營養缺陷型突變菌KAG0U作為親本，進行原生質體細 胞的融合，獲得融合子RHZ-2 ; 2. 2)將融合后的懸浮液涂布到平板上，對長出的融合子RHZ-2進行篩選，篩選出同時 具有絮凝性和耐酸能力且發酵性能最佳的菌株，該菌株即為釀酒酵母SEB4。
[0014] 本發明W2個工業釀酒酵母為親本菌株，結合紫外誘變及原生質體融合技術，獲 取了 1株發酵性能較好的耐酸絮凝性酵母菌株，可為燃料乙醇的生產提供優良的微生物資 源。本發明的方法構建出的菌株，不僅兼有雙親遺傳性狀，即具有親本融合子RHZ-1良好的 絮凝性和發酵能力，和親本SEB2良好的耐酸能力；而且還能有效提高融合后菌株遺傳性狀 性能，即本發明的方法構建的融合菌株在乙醇產量、葡萄糖消耗量及葡萄糖消耗速率上均 優于親本菌株。
[0015] 進一步，所述紫外誘變的具體操作過程如下： 將融合子RHZ-1和SEB2分別轉入2 %YTO培養基中，30°C活化16h;菌液經無菌水 稀釋后涂布到YTO平板上，平板在紫外燈下照射50S后，于30°C靜置培養即可。
[0016] 更進一步地，所述單種營養缺陷型突變菌的篩選過程如下： 將經紫外燈處理的YTO平板培養的菌株落影印至MM平板上，并于30°C過夜培養，對 比YTO及MM平板長出的菌落，從YTO平板上挑選出無法在MM平板生長的菌落，即營養缺陷 型突變菌； 向MM平板添加不同的營養物質，每個平板1種營養物，將營養缺陷型突變菌同時接種 到YTO及MM平板上培養，鑒定其營養缺陷類型，并篩選出單種營養缺陷型突變菌。 陽017] 其中，2%YTO培養基包括：20gパ葡萄糖、10 酵母浸出粉、20 蛋白腺，其余 為蒸饋水;匪培養基包括：1. 7 無氨基酵母氮源、10 酵母粉、20 葡萄糖，其余 為蒸饋水。平板在培養基的基礎上添加了 20 的瓊脂。
[001引本發明與現有技術相比，具有W下優點及有益效果： 本發明中