靈芝高產菌株選育方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及微生物的發酵技術領域，具體為一種靈芝高產菌株選育方法。
【背景技術】
[0002] 目前，不管是在實驗室的研究或者工廠工業化生產過程中，發酵產業尤其是絲狀 真菌發酵都是一個操作復雜，穩定性較差的生產方式，主要存在菌種保存過程中活力會逐 漸降低、菌種傳代過程中也會隨傳代次數增加而顯著降低、菌種突變率高(運些突變中生長 能力減弱和次級代謝產物的降低往往占據了突變的絕大部分比重）等問題，導致很多實驗 研究或者發酵生產都很難精確預測出發酵終點時的生長狀況。而常見的檢測方法也難W在 短時間內得出結論，即便得出結論需要調整，也難W在為期數日的發酵時間內對發酵結果 產生明顯的改善，導致發酵過程控制對發酵結果的影響力就相對更弱。因此，菌種的質量就 成了影響發酵的十分重要甚至決定性的因素。
[0003] 而目前的菌種選育通常是通過自然突變高產菌株或者人工誘變手段進行，往往存 在誘變周期長，成功率低，工作量大的問題。同時又導致保存過程繁雜，保存菌株在使用前 又需要冗長的活化工作，加劇了菌株選育的難度和工作量。
【發明內容】
[0004] 本發明為了意在提供一種縮短菌株保藏環節，降低了菌種活化的培養周期，能大 量篩選出高產靈芝多糖的菌株選育方法。 陽〇化]本發明提供基礎方案是：靈芝高產菌株選育方法，其操作步驟如下： A、 菌種活化：取韓國短柄赤芝菌種和日本鹿角靈芝菌種，韓國短柄赤芝菌種與日本鹿 角靈芝菌種的比例關系為1: 1，將兩種菌種用PDA基礎培養基于28°C震蕩培養5~7d; B、 在其中一種菌種的穩定期將其接種在PDA復合培養基中，放置在28Γ的搖床中震蕩 培養4~6d，另一種菌種在對數生長期將其接種在PDA復合培養基中，放置在28°C的搖床中 震蕩培養2~4d，PDA復合培養基是在PDA基礎培養基的基礎之上加入1. 5%憐酸二氨鐘和 0. 75%硫酸儀； C、 選擇原始高產菌種用于發酵生產； D、 將步驟C的高產菌種通過四至五代傳代培養，當菌種的質量下降時，對其進行外部 刺激， E、 外部刺激：在無菌環境下，使用20ml勻漿器對菌液進行勻漿處理，再將勻漿后的菌 液按照10%的接種量接種在多個新的復合培養液培養； F、 選擇篩選優質的菌株進行擴培培養； G、 當步驟E中新的復合培養液中的菌種出現質量下降時，重復操作步驟E、F。
[0006] 本發明靈芝高產菌株選育方法，步驟A，韓國短柄赤芝菌種、日本鹿角靈芝菌種的 選擇，從窄義的理解來說，因為靈芝科中的一個品種是赤芝，是常見的代表品種，被人們稱 習慣了叫靈芝，實際上它的學名是赤芝；野生赤芝并不是都有菌柄，有柄或近無柄或無柄； 靈芝菌柄紅褐色至黑色，都有漆樣光澤，堅硬；我國是靈芝的故鄉，但目前我國靈芝產業中 所用的菌種存在著嚴重的品種退化及質量下降等問題，品質較高的靈芝種大多依靠從日 本、韓國引進，將兩種菌種用PDA基礎培養基震蕩培養將其活化。步驟B，通過不同生長階段 和不同菌株種群之間在共同生長環境中的競爭性作用，自然激發其生長能力，從而有更高 的幾率培養出高產混合菌株。步驟C，對混合菌種生長能力進行進一步擇優篩選，從而獲得 原始高產母種用于發酵生產。步驟D，對高產菌種進行擴大培養，當菌種質量下降時，采取外 部刺激的方式達到選擇優質菌株的目的。步驟E，外部刺激操作的目的在于打破原有菌球形 態，將過大的細胞勻漿破裂死亡，留下活力較好的體積較小的新生細胞和抱子，使破碎的大 細胞中的生物活性大分子釋放出來，刺激或供給活力好的細胞及抱子進行生長，從而達到 在不重新開始發酵選育過程的情況下就能夠直接對菌種進行原位處理，同時在多個培養容 器中再次進行各項指標驗證，從而達到篩選優質菌株的目的。步驟F，從中選擇優質的菌株 進行移植擴大培養，而其余的菌株則繼續培養。步驟G，當菌種的質量出現下降時，再次外部 刺激選擇優質的菌種，從而可反復選擇、保存。
[0007] 本發明是集"菌種活化"、"菌種保藏"、"菌種誘變"、"菌種篩選"、"菌種傳代保種" 等一系列內容為一體的整體實驗體系。相比傳統的菌種"活化-傳代-篩選-保存"方法， 本方法的優勢在于：一是活化過程中不需要多次傳代，從而節約了大量精力和時間，能夠隨 時直接應用于生產或者研究；二是保存過程只需要冷藏保種，時間短，通常是在高產菌株選 育出太多難W用完的情況下進行暫時保存，不存在傳統的保藏操作繁瑣，保存中活力變化 不穩定等劣勢；Ξ是菌種篩選并非盲目的"鳥槍法"，而是更有針對性進行篩選，成功率和高 產獲得率都高于傳統方法(通常在所有選育樣本中有1〇%-15%的幾率出現高產菌株）；四是 傳代過程中出現問題不需要舍棄該菌株，而是直接可W通過操作對該菌株進行處理，刺激 其本身活力恢復，不需要另外使用保存菌株進行活化。
[0008] 進一步，所述步驟C中選擇原始高產菌種是選擇細胞形態為球型或楠球型，菌絲 蔓延速度>Icm/d，色素產生能力為第2-3d開始產生黃色色素、培養結束時為深黃色，靈芝 多糖產量為同批次中最高和胞內靈芝多糖為90%W上的菌種。僅是判斷的基本量化選擇， 也可根據經驗相對選擇高產菌種。
[0009] 進一步，所述步驟D中當菌種的質量下降時的依據為：培養液中抑值為2. 8-3. 0， 菌體干重低于5g/l，靈芝多糖產率低于20%，靈芝菌球靜置密度為搖瓶靜置后發酵液總體 積減去上清液后所占體積低于90%，靈芝菌球直徑低于2mm或者高于5mm，多個靈芝菌球直 徑標準差大于2mm，靈芝菌球表面形態趨于光滑，外延菌絲長度低于0. 5mm，菌球顏色趨于 白色或者褐色。僅是基本的量化選擇，也可根據經驗相對判斷菌種的質量下降。
[0010] 進一步，所述步驟E中勻漿處理的時間為10~15個往返。
【附圖說