自血漿純化免疫球蛋白的制作方法
【專利說明】自血漿純化免疫球蛋白
[0001] 本發明設及自血漿純化祀分子像免疫球蛋白。基于親水性的化學上穩定的聚乙締 酸樹脂的某些類型的離子交換劑的使用導致祀分子的特別高的收率。
[0002]發巧背景 人和動物血包含許多蛋白和酶，其具有例如治療性質。運些蛋白的一些可在紅細胞中 發現，而其它的在血漿或血清的溶液中發現。運樣的蛋白是用于大規模和特異性分離的目 標，目的是純化和標準化所述蛋白用作人治療劑。分離W供治療應用的重要血蛋白的實例 有：白蛋白、免疫球蛋白G、因子IX、因子VIII和α-1-蛋白酶抑制劑。運些蛋白的一些W 每年數千kg的規模生產（白蛋白和IgG)，而其它的僅W每年克至千克的規模生產。然而， 為了分離運些蛋白，在全世界范圍內，每年有數百萬升的血液被處理。
[0003] 血、血漿和血清是極其復雜的含蛋白質的溶液，其包含許多并非目的蛋白或酶的 其它類型的化合物。從運種類型的樣品分離特異性祀分子需要復雜的且往往是多步的純化 程序。
[0004] 特別是免疫球蛋白G的當前生產方法的一個常見問題是純化過程中免疫球蛋白G 的大量流失，估計為起始原料的總IgG含量的至少30%-35%。一個挑戰是保持病毒失活和缺 乏可引起不良反應的雜質的品質，同時擴大IgG的收率。在可被考慮的目前的IgG生產水 平下，收率的小幅度增加實際上是非常重要的。即使效率的2%增加也將在收率和生產力方 面產生顯著的增加。
[0005] 因此，存在對改進的和更有效的生產IgG產品的方法的需求。
[0006] 發巧簡沐 已經發現，某種類型的色譜材料或基質可W非常有效地用于來自血漿樣品的祀分子的 陰離子交換純化。所述基質是攜帶600和1200帕ol/g之間的陰離子基團的親水性聚乙締 酸。祀分子可W非常高的收率和極好的純度獲得。
[0007] 本發明因此設及一種自血漿樣品純化祀分子的方法，其通過W下方面進行： a) 提供包含祀分子的血漿樣品， b) 使所述血漿樣品經受在攜帶600和1200帕ol/g之間的陰離子基團的聚乙締酸基 質上的離子交換色譜，藉此自基質中洗脫純化的祀分子。
[0008] 在優選的實施方案中，所述基質是一種由至少一種來自組a)和b)的化合物的共 聚而形成的共聚物，其中 a)至少一種式I的親水取代的烷基乙締基酸
其中R1、R2、R3彼此獨立地可W是Η或C1-C6烷基，優選地Η或CH3， 和R4是攜帶至少一個徑基的基團 和 b)至少一種符合式II和/或III和/或IV的交聯劑，
其中X是具有2-5個C原子、優選2或3個C原子的二價烷基，其中不鄰近的和不位 于N的直接附近的一個或多個亞甲基可W被0、C=0、S、S=0、S02、NH、NOH或N替代和所述亞 甲基的一個或多個Η原子可W彼此獨立地被徑基、C1-C6-烷基、面素、Ν&、C5-C10-芳基、 ΝΗ- (C1-C8)-烷基、N(C1-C8)-烷基2、C1-C6-烷氧基或C1-C6-烷基-0Η取代，和
其中在式III和IV中的Y1和Y2彼此獨立地是C1-C10烷基或環烷基，其中一個或多 個非-鄰近的亞甲基或不位于N的直接附近的亞甲基可W被0、C=0、S、S=0、S〇2、畑、N0H 或N替代和所述亞甲基的一個或多個Η可W彼此獨立地被徑基、C1-C6-烷基、面素、NHz、 C5-C10-芳基、NH(C1-C8)烷基、N(C1-C8)烷基 2、C1-C6-烷氧基或C1-C6-烷基-OH取代， 或C6-C18芳基，其中芳基系統中的一個或多個Η可W彼此獨立地被徑基、C1-C6-烷基、 面素、畑2、NH(C1-C8)烷基、N(C1-C8)烷基2、C1-C6-烷氧基或C1-C6-烷基-0Η取代訊 A是具有2-5個C原子、優選2或3個C原子的二價烷基，其中一個或多個非-鄰近的 亞甲基或不位于N的直接附近的亞甲基可W被0、C=0、S、S=0、S〇2、畑、N0H或N替代和所 述亞甲基的一個或多個Η可W彼此獨立地被徑基、C1-C6-烷基、面素、Ν&、C5-C10-芳基、 NH(C1-C8)烷基、N(C1-C8)烷基2、C1-C6-烷氧基或C1-C6-烷基-0Η取代。
[0009] 式I中的R4通常為攜帶至少一個徑基的烷基、環脂族基團或芳基。
[0010] 在非常優選的實施方案中，所述基質通過所用的親水取代的烷基乙締基酸和作為 交聯劑的二乙締基乙締脈（1,3-二乙締基咪挫嘟-2-酬）的共聚而形成，所述烷基乙締基 酸選自1,4-下二醇單乙締基酸、1,5-戊二醇單乙締基酸、二乙二醇單乙締基酸或環己燒二 甲醇單乙締基酸。
[0011] 在優選的實施方案中，離子基團已通過使聚乙締酸基質經受姉催化的接枝聚合而 附接于基質。運優選地依據US5453186第9頁實施例8進行，其中荷電基團優選地是帶正 電荷的Ξ甲基錠烷基。
[0012] 在優選的實施方案中，離子交換基團是帶正電荷的Ξ甲基錠烷基。
[0013] 在優選的實施方案中，離子交換色譜W流通模式進行。
[0014] 在優選的實施方案中，祀分子是免疫球蛋白，優選人免疫球蛋白，最優選人免疫球 蛋白G。
[0015] 在另一個實施方案中，所述勒1分子從IgA、IgM、白蛋白、轉鐵蛋白和因子XIa分離。
[0016] 在另一個實施方案中，步驟b)中的基質用具有4和7. 4之間的pH的緩沖液洗脫。
[0017] 在一個實施方案中，將樣品W樣品中25-150g蛋白/每升基質的量施加于所述基 質。
[0018] 在優選的實施方案中，步驟b)中的基質的負載和洗脫用包含0. 005和1Μ之間乙 酸鹽的乙酸鹽緩沖液進行。
[0019] 在一個實施方案中，所述基質由具有20和250化之間的平均粒徑的顆粒制得。
[0020] 所述基質的孔徑（例如孔半徑）指顆粒在表面改性反應前的孔徑并通過逆尺寸排 阻色譜測定。用于測定的程序描述于文獻（JournalofC虹omatogra地yA, 1037卷，1-2 期，273-282 頁）。
[0021] 在一個實施方案中，孔半徑在30-150nm之間。
[0022] 在一個實施方案中，在從步驟b)中的基質洗脫祀分子后，在隨后的步驟C)中，基 質用具有低于步驟b)所用的緩沖液抑的抑的緩沖液洗脫，從而自基質中洗脫含IgM的產 物。
[0023] 在一個實施方案中，在從步驟b)中的基質洗脫祀分子后，在隨后的步驟C)中，基 質用具有低于步驟b)所用的緩沖液抑的抑的緩沖液處理，由此從所述基質洗脫IgA、IgM 和因子XI曰。
[0024] 定女 在詳細描述本發明之前，將要理解的是，本發明并不限于特定組成或過程步驟，因為所 述組成或步驟可能會有所不同。必須注意到，如用于本說明書和所附權利要求書中的，單數 形式"a"、"an"和"the"包括復數指代，除非上下文中另外清楚地指明。因此，例如，提及" 配體"包括多種配體和提及"抗體"包括多種抗體等。
[00巧]除非另外限定，否則本文所用的全部技術和科學術語，具有本發明所設及領域的 普通技術人員通常理解的相同意義。為了如本文所述的本發明的目的，定義W下術語。 [00%] 本文所用的術語"祀分子"指應從樣品的一個或多個其它成分，例如雜質中分離、 分開或純化的任何分子、物質或化合物。祀分子的實例有抗體、抗原結合片段（Fab)、恒定 區片段（Fc)、蛋白質、膚、重組蛋白、其它天然化合物。在優選的實施方案中，祀分子是蛋白 質。在一個非常優選的實施方案中，祀分子是抗體。在一個特別優選的實施方案中，所述祀 分子是免疫球蛋白。在生產和/或純化過程中，祀分子通常存在于液體中。液體可W是水、 緩沖液、非-水性溶劑像乙醇或其任何混合物。除了祀分子，所述液體還可包含一或多種雜 質。液體的組成可在生產和/或純化期間根據進行的過程步驟而改變。在色譜步驟后，由 于色譜步驟所用的洗脫劑，液體通常包含比之前更多的其它溶劑。典型地只有經過最后的 純化步驟后，祀分子才可被干燥，供制備最終的劑型。
[0027] 術語"抗體"指具有特異性地結合于抗原的能力的蛋白質。"抗體"或"IgG"還 指基本上由一種或多種免疫球蛋白基因或其片段編碼的多膚，其特異性地結合和識別分析 物（抗原）。識別的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、丫、5、ε和μ恒定區基因，W及無 數免疫球蛋白可變區基因。輕鏈被分類為或者Κ或者λ。重鏈被分類為丫、μ、α、δ或 ε，其依次分別定義免疫球蛋白種類IgG、IgM、IgA、I曲和I姐。
[0028] 一種示例性免疫球蛋白（抗體）結構單元由兩對多膚鏈組成，每一對具有一條" 輕鏈（約25kD)和一條"重"鏈（約50-70kD)，所述鏈，例如，通過鏈間二硫鍵穩定。每 條鏈的N-末端限定一個主要負責抗原識別的約100-110或更多氨基酸的可變區。術語可 變輕鏈（VL)和可變重鏈（VH)分別指運些輕鏈和重鏈。
[0029] 抗體可W是單克隆