Cd7受體適配體的制作方法
【技術領域】
[0001]本申請涉及核酸適配體（aptamer)，其能夠特異性識別、結合表達淋巴細胞-特異 性CD7受體的細胞和內化到該細胞中。因此，本發明能夠用于診斷和治療與淋巴細胞有關 的疾病和感染。
【背景技術】
[0002] 分子向靶細胞的特異性遞送已經使醫學領域困惑了數十年之久，并同時產生了對 這種工具的需要。存在大量的將分子遞送到細胞中的機制（例如，脂質體、病毒載體和陽離 子多聚物試劑（polyplexreagents))，但這些機制限于一些方式，顯然大多數機制并不能 在異質細胞群中選擇性遞送，如在人類器官和組織中所發現的。為了安全和有效地遞送分 子，需要開發替代性醫學工具，其不僅是非免疫原性的，而且能夠在混合的群中選擇性鑒定 靶細胞。適配體已經顯示出滿足該需要的潛力。
[0003] 適配體是能夠被分離以結合于大分子陣列的人工核酸分子（Reviewedin Khati(2010))。與其靶標具有高親和性的高度選擇性適配體的選擇和設計使得開發出大量 能夠結合分子陣列的適配體。Gold(Tuerk，199)和Szostak(Ellington，1990)小組的先前 的工作分別確定了用于特異性結合于有機染料和T4DNA聚合酶的適配體選擇的體外方法。 這種方法被稱為指數富集的配基系統進化技術（SystematicEvolutionofLigandsby Exponentialenrichment，SELEX)，其已被應用于簡化適配體的選擇過程。適配體已被開發 為特異性靶向HIV表面糖蛋白gpl20并抑制病毒進入（Khati，2003 ;Zhou，2009)。利用其 靶標特異性，已經將這些適配體鑒定為用于將Dicer底物siRNA靶向遞送至特定細胞的遞 送載體（Zhou, 2009 ;McNamara，2006)。短干擾RNA(siRNA)是與輔助分子一起作用以使靶 基因轉錄后沉默的小RNA分子。這些強力的沉默分子僅在細胞質中活化一次并且不能單獨 地有效內化。因此，它們需要活性遞送到細胞中。適配體已被鑒定為不僅用于siRNA而且 還用于納米顆粒的有效遞送劑（Dhar，2008)。最近，抗-gpl20適配體和抗-tat/revsiRNA 嵌合體顯示出減少人源化小鼠中的病毒復制和輔助性CD4+T細胞耗竭（Neff，2011)。該嵌 合體不會引出內含子應答，這不同于用脂質體或陽離子多聚物試劑介導的siRNA遞送所觀 察到的（Zhou, 2009)。
[0004] 目前的HIV靶向SiRNA-適配體綴合物通過感染的細胞膜上的靶向HIV糖蛋白 (gpl20)殘基而指向感染的淋巴細胞（Zhou，2009)。淋巴細胞/單核細胞中的CD4受體已 被用于革向用于內化作用的適配體-SiRNA嵌合體（Wheeler, 2011)。然而，在1-4μΜ范圍 離體條件下作用時，CD4適配體并不是針對內化作用選擇的且十分低效。
[0005] ⑶7是在Τ和Β淋巴細胞、自然殺傷細胞和樹狀突細胞的前體上表達的泛-白細 胞受體（Hao, 2001 ;Sempowki, 1999)，其在Τ細胞激活中起輔助作用（Lazarovits, 1994 ; Stillwell, 2011)并且長存于成熟CD4+細胞的表面上（Cotta, 2006 ;Lobac, 1985)。CD7 作為用于白血病和淋巴瘤治療的細胞毒性分子遞送的靶標已被廣泛研究（Peipp，2002 ; Bremmer, 2006 ;Franker, 1997 ;Vallera, 1996 ;Waurzyniak, 1997)。先前已經不出了利用通 過靶向于⑶7綴合至siRNAs的單鏈單克隆抗體以用于遞送HIV治療劑（siRNAs)，存在病毒 感染的保護性抑制（Kumar，2008)。Kumar(2008)的研究使用了靶向藥物遞送的抗體，其精 心構思和復雜綴合方法以用于連接效應子分子。
[0006] 因此，仍需要將靶子分子遞送至表達⑶7細胞表面受體的細胞的克服了至少一些 上述問題的方法。
【發明內容】
[0007] 根據本發明的第一種實施方式，提供了長度不超過100個核苷酸的適配體分子， 其包含與序列 5'GGGAGACAAGAAUAAGCAUG-RfUUCGACAGGAGGCUCACAACAGGC3'（SEQIDN0:3) 具有至少80%同一性的核苷酸序列，
[0008] 其中札為ηx，其中每個η代表任意核苷酸，且X為20至55的整數，并且
[0009] 其中，該適配體分子能夠選擇性結合于表達⑶7受體的細胞。
[0010]該適配體分子可具有與序列 5'GGGAGACAAGAAUAAGCAUG-RfUUCGACAGGAGGCUCAC AACAGG3'（SEQIDN0:123)或 5'GGGAGACAAGAAUAAGCAUG-RfUUCGACAGGAGGCUCACAACAG 3'（SEQIDNO: 124)具有至少80%同一性的核苷酸序列。
[0011]X可更優選地為29至55的整數，并且甚至更優選地為39至55的整數。甚至更優 選地，X可以為39至49的整數。
[0012] 札可以具有SEQIDN0S:4-57中任一個的核苷酸序列。
[0013] 該適配體分子可以包含至少68個核苷酸，并且更優選地包含至少80個核苷酸，例 如84至90個核苷酸。
[0014] 該適配體分子可以與SEQIDN0:3具有至少85%，至少90%，至少95 %或100% 的同一"性。
[0015] 該適配體分子可以包含SEQIDN0S:58-111中任一個所列出的核酸序列。
[0016] 該分子的一個或多個核苷酸堿基可以已經被修飾。
[0017] 該適配體分子能夠被內化到表達⑶7的細胞中。
[0018] 該適配體分子可被用于向具有CD7受體的細胞遞送治療或診斷分子。
[0019] 根據本發明的第二種實施方式，提供了包含如上文所述的連接至治療或診斷分子 的適配體分子的綴合物。
[0020] 根據本發明的第三種實施方式，提供了包含如上文所述的適配體分子或綴合物和 可藥用載體的藥物組合物。
[0021] 根據本發明的第四種實施方式，提供了用于向具有CD7受體的分子遞送治療或診 斷分子的方法，該方法包括使該細胞與如上文所述的適配體或綴合物接觸。
[0022] 根據本發明的第五種實施方式，提供了用于檢測表達CD7的細胞的方法，該方法 包括使細胞與如上文所述的適配體或綴合物接觸，并且當該適配體或綴合物結合至或被細 胞內化時進行檢測。
【附圖說明】
[0023]圖1:為詵擇內化話配體的全細朐SELEX實驗方案。利用全細朐來詵擇內化話配 體。從將dsDNA文庫轉錄為f氟化嘧啶RNA文庫開始，利用CD7-HeLa細胞進行正向選擇。 在37°C下將RNA與⑶7-HeLa細胞一起孵育，之后棄上清，并將結合的RNA從細胞清洗掉。 通過裂解細胞回收內化的RNA，并將回收的RNA逆轉錄為cDNA，并通過PCR進行擴增，之后 轉錄為RNA以用于下一輪選擇。在HeLa細胞中的負向選擇用于除去任何非特異性內化的 RNA。對于此，在將細胞與RNA的富集池一起進行孵育之后，棄細胞并保留上清以產生更多 的模板。繼續進行該選擇直至從每一輪的回收到達平臺期。
[0024] 圖2:PilotPCR用于最優化SELEXDNA擴增的循環次數。針對循環次數最優化毎 一輪選擇的DNA的PCR擴增。在24次循環之后觀察到模板的過度擴增，而在16次循環之 前沒有產生產物。在20次擴增時，能夠看到作為與75個核苷酸對齊的較下方條帶的引物 二聚體擴增。在100個核苷酸處的感興趣條帶從16次循環得到證實。最佳循環次數產生 感興趣的條帶，而沒有異常條帶。
[0025] 圖3 :從內化（體內）全細朐SELEX回收。在CD7_HeLa細胞中的5輪正向選擇和 在未轉染的HeLa細胞中的一輪負向選擇之后選擇CD7特異性內化適配體。在未轉染的HeLa 細胞中重復每一輪的回收以確認富含CD7特異性適配體。從未轉染的HeLa細胞的回收保 持恒定，而在⑶7-HeLa細胞中則顯示出在每一輪中的富集。
[0026] 圖4:在最后一輪詵擇之后的CD7特異件話配體的富集池的PCR擴增。通討低鎂 濃度PCR來擴增⑶7特異性適配體的富集池。該PCR得到根據分子量標志物具有正確尺寸 的單條條帶。一旦確認了正確尺寸和質量，就將DNA連接到pGEM-TEasy?^^本中。
[0027] 圖5:利用M13引物講行載體插入篩詵。利用M13特異性引物擴增96個克隆，以 確定插入陽性克隆。通過指示箭頭處的條帶來證實該陽性插入。在感興趣條帶下方可見過 量的載體DNA的條帶，其表征PCR中過量載入的模板。
[0028] 圖6 :話配體序列的最大可能件講化樹。來自全細胞SELEX的適配體序列被排列 于鄰接樹并在鄰接樹上作圖，以確定該序列中的相似性。適配體序列僅與三個入池超過一 次的適配體（CSIR3. 3、CSIR3. 23和CSIR3. 53)有區別。
[0029] 圖7 :通討PCR和體外轉錄產牛CD7話配體。A.在轉錄為活性RNA之前通過PCR 擴增適配體。能夠看到適配體（尺寸為90bp)對齊于100個核苷酸處的分子標記物。B.將 通過PCR擴增的適配體轉錄為其活性RNA。在8M變性聚丙烯酰胺凝膠上分離DNAse之前 (BD)和DNAse(AD)之后的餾分。BD中的多個條帶指示DNA和RNA分子。
[0030] 圖8記的適配體RNA的分光光度計定量分析。利用分光光度法對用勞光團標 記的RNA進行定量分析。標記示出RNA和標記物的光譜，并計算標記的RNA的量。
[0031] 圖9 :通討流式細朐術在HeLah鑒別的特異于⑶7-HeLa細朐的話配體。話配體 CSIR3. 3、CSIR3. 23和CSIR3. 53結合于CD7-HeLa細胞和未轉染的HeLa細胞。結合不 同細胞類型的適配體的覆蓋直方圖。僅細胞對照為灰色陰影，而結合CD7_HeLa細胞和未轉 染的HeLa細胞的適配體則分別為紅色和綠色的線。B.結合歸一化為僅細胞對照的適配體 設為 1(η= 4)。
[0032] 圖10 :話配體CSIR3. 23結合特異件。格CD7_HeLa細胞和未轉染的HeLa細胞與 20nMFAM標記的適配體CSIR3. 23-起孵育。CellMask全細胞染色用于使細胞可視化并 定位適配體染色。產生細胞和適配體染色的復合照片。
[0033] 圖11 :話配體CSIR3. 3結合特異件。格CD7_HeLa細胞和未轉染的HeLa細胞與 20nMFAM標記的適配體CSIR3. 3-起孵育。CellMask全細胞染色用于使細胞可視乎并定 位適配體染色。產生細胞和適配體染色的復合照片。
[0034] 圖12 :話配體CSIR3. 53結合特異件。格CD7_HeLa細胞和未轉染的HeLa細胞與 20nMFAM標記的適配體CSIR3. 53-起孵育。CellMask全細胞染色用于使細胞可視乎并 定位適配體染色。產生細胞和適配體染色的復合照片。
[0035] 圖13 :在存在和不存在抗-CD7單克降抗體競爭的條件下，CD7話配體結合對比。
[0036] 圖14 :在⑶7-HeLa細朐h結合于⑶7夸體的話配體CSIR3. 42的顯微鏡分析。第 一泳道為亮視野像，第二條帶為適配體染色（歸為偽彩色，紅色）以及最后條帶為最初兩幅 圖像的復合。A.在4°C下與CSIR3. 42-起孵育的⑶7-HeLa細胞。能夠觀察到適配體染 色，其定位于細胞周圍（白色箭頭）。B.用抗-CD7抗體阻斷CD7-HeLa細胞，之后在4°C下 與CSIR3. 42 -起孵育。能夠觀察到適配體染色，其定位于細胞周圍（白色箭頭）。
[0037] 圖15 :話配體CSIR3. 42夸體介導的向CD7_HeLa細朐中內化作用的顯微鏡分析。 適配體結合于表達⑶7受體的表面并加溫至37°C。第一泳道為亮視野像，第二泳道為適配 體染色（歸為偽彩色，紅色）；第三泳道為核染色（歸為偽彩色，藍色）以及最后泳道為適 配體染色和核染色圖像的復合。A.在4°C下將⑶7-HeLa細胞與CSIR3. 42 -起孵育20分 鐘，用無血清培養基洗滌并升溫至37°C。能夠觀察到適配體染色定位至細胞內部，細胞核周 圍（白色箭頭）。B.用抗-⑶7抗體阻斷⑶7-HeLa細胞，之后在4°C下與CSIR3. 42 -起孵 育20分鐘，用無血清培養基洗滌并升溫至37°C。未出現適配體染色。
[0038] 圖16 :話配體與在Turkat細朐h內源件表汰的CD7夸體的關聯度。
[0039] 每一適配體的關聯度單獨歸一化為其各自轉染對照（設置為100% )。學生氏t檢 驗用于確定僅有適配體和其轉染對照之間的顯著性（η= 2)。除CSIR3. 14和CSIR3. 42 之外的所有的適配體都顯著不同于其轉染對照。
[0040] 圖17 :話配體CSIR3. 14的時稈關聯度。Pi· 400nM的終濃度將適配體CSIR3. 14 與Jurkat細胞一起孵育不同的時間（1小時、3小時、6小時、12小時和24小時）。A:在不 同孵育期過后適配體結合的覆蓋頻率分布圖。適配體結合隨孵育期的增加而增加。B:隨時 間的適配體結合的非線性回歸擬合（特異性關聯度=體X丨()〇 )。
[0041] 圖18 :話配體CSIR3. 37的時稈關聯度。Pi· 400nM的終濃度將適配體CSIR3. 37 與Jurkat細胞一起孵育不同的時間（1小時、3小時、6小時、12小時和24小時）。A:在不 同孵育期過后適配體結合的覆蓋頻率分布圖。適配體結合隨孵育期的增加而增加。B:隨時 間的適配體結合的非線性回歸擬合（特異性關聯度=X!()〇)"
[0042] 圖19 :話配體CSIR3. 42時稈關聯度。Pi· 400nM的終濃度將適配體CSIR3. 42與 Jurkat細胞一起孵育不同的時間（1小時、3小時、6小時、12小時和24小時）。A:在不同 孵育期過后適配體結合的覆蓋頻率分布圖。適配體結合隨孵育期的增加而增加。B:隨時間 的適配體結合的非線性回歸擬合（特異性關聯度=比xHK)
[0043] 圖20 :適配體CSIR3. 14的結合動力學分析。以不同濃度（11ηΜ、22ηΜ、44ηΜ、87ηΜ、 175ηΜ、350ηΜ和700ηΜ)將適配體CSIR3. 14與Jurkat細胞一起孵育12小時。Α.在不同 濃度時適配體結合的覆蓋頻率分布圖。B.在不同濃度時配體與Jurkat細胞的特異性關聯 度（特異性關聯度=?本.X】00).. '又 C5i.s 3.31^^^·lib
[0044] 圖21:適配體CSIR3· 37的結合動力學分析。以不同濃度（11ηΜ、22ηΜ、44ηΜ、87ηΜ、 175ηΜ、350ηΜ和700ηΜ)將適配體CSIR3. 37與Jurkat細胞一起孵育12小時。Α.在不同 濃度時適配體結合的覆蓋頻率分布圖。B.在不同濃度時配體與Jurkat細胞的特異性關聯 J i- a-Δ. ? 遠配體it夥IT-分比，、 度=--χ100),.
[0045] 圖22:適配體CSIR3. 14全長突變體和CSIR3. 14DNA與Jurkat細胞的關聯度。將 適配體CSIR3. 14RNA、突變體和DNA以400nM的終濃度與Jurkat細胞一起孵育過夜。A.通 過實體框（solidbox)來表示適配體二級結構的計算機預測、CSIR3. 14RNA的建議結合 區。B.不同濃度時的適配體結合的覆蓋頻率分布圖（灰色陰影中僅細胞對照）。C.適配體 剛中型與Jurkat細胞的特異性關聯度（特異性關聯度=χ削)。
[0046] 圖23 :通討共聚隹顯微鏡的Z切片通討圖像截而。A:X、Y和Z屏幕視角的圖形表 示。Β:每Ιμπι切開的可視平面的圖形表示以產生Ζ堆疊。
[0047] 圖24:以1μm間隔沿著Ζ軸從細胞下方至細胞上方僅沿著Ζ軸通過僅單個細胞 的圖像切片用于定位適配體CSIR3. 14圖像切片。在Ο.Ομπι處的第一圖像位于細胞下方， 而在23. 0μπι處的最終圖像位于細胞上方。9. 0μπι和15. 0μπι之間的圖像來自細胞內部。
[0048] 圖25:話配體CSIR3. 14內化作用的時稈。在加入話配體之后長汰45分鐘的適 配體CSIR3. 14內化作用的圖像。以15分鐘的間隔在六小時內獲取圖像。
[0049] 圖26:感興趣岡域內的內化作用的動力學（全視野場）。
[0050] 選擇包括全部可是平面的感興趣區域以用于計算內化作用動力學。A.彌補R0I 1 的面積。B.用非線性回歸線擬合的隨時間變化的熒光強度。由虛線來表示該線的95%置 信區間。C.非線性回歸線的計算參數。
[0051] 圖27:感興趣的兩個（單個細朐）岡域的內化作用的動力學。詵擇含有單個細朐 的兩個感興趣區域以用于計算內化作用動力學。A.表示全部可見平面環境下單個細胞的 彌補R0I2的區域。B.用非線性回歸線擬合的隨時間的熒光強度。由虛線來表示該線的 95%置信區間。C.非線性回歸線的計算參數。
[0052] 圖28 :三種CD7話配體-siRNA嵌合體的設計。
[0053] 圖29 :用話配體-siRNA嵌合體和對照轉染的CEM細朐并通討aRT-PCR對CCR5抑 制講行測試。
[0054] 圖30:在CEM細胞中CD73. 37R5-siRNA的細胞內化作用。siRNA為用Cy3熒光團 標記的3'-端。向CEM細胞施用800nM的適配體-嵌合體并通過熒光顯微鏡可視觀察。用 DAPI對細胞核進行反染色。數據表示適配體-嵌合體至CEM細胞的具體定位。
【具體實施方式】
[0055] 本發明提供了特異性結合于表達CD7細胞表面受體的細胞或組織的核酸適配體。 該適配體包含與核酸序列5' -GGGAGACAAGAAUAAGCAUG-RfUUCGACAGGAGGCUCACAACAGGC-3'（ SEQ IDN0:3)具有至少80%同一性的核酸序列的分子，其中^為!^，其中每個η代表任意 核苷酸且X為29至55的整數。
[0056] 除非另外定義，否則本文中使用的所有的技術和科學術語具有與本發明領域的普 通技術人員通常理解相同的含義。通常，本文中使用的專用術語和試驗方法是本領域公知 的并且是本領域中常用的。
[0057] 如在本文中使用的，術語"核酸適配體"是指能夠以高親和性特異性識別其靶標的 小的單鏈寡核苷酸。
[0058] 如在本文中使用的，短語"與…具有至少80% /85% /90% /95 %同一性的核酸序 列"是指相對于參比序列包含一個至若干個核苷酸添加、缺失或置換的核酸序列。
[0059]申請人已經示出了 具有核酸序列 5' -GGGAGACAAGAAUAAGCAUG-RfUUCGACAGGAGGCU CACAACAGGC-3'（SEQIDN0:3)或其修飾的適配體能夠結合于表達⑶7受體的細胞和/或被 內化到表達⑶7受體的細胞中。該具有SEQIDN0S:58至111的分子是這樣的適配體的具 體實例。
[0060] 適配體能夠具有與提供的SEQIDN0:3具有至少85% ,90%或95%同一性的序 列，然而，該適配體能夠結合于表達CD7受體的細胞或組織或被內化到表達CD7受體的細胞 或組織中。該適配體能夠與SEQIDN0:3完全相同。引起與SEQIDN0:3具有至少80%、 85 %、90 %或95 %同一性的修飾通常為位于側接于&的核苷酸上的修飾，其可