細胞內表型篩選的制作方法
【專利說明】細胞內表型篩選
[0001] 本發明涉及用于鑒定涉及細胞表型的細胞靶標的方法，包括鑒定能修飾細胞表型 的胞內抗體和鑒定胞內抗體的直接或間接的細胞靶標。本發明還涉及能抑制由過敏性刺激 引發的肥大細胞上的脫顆粒反應的胞內抗體，尤其是涉及胞內抗體3H2-U3H2-VH和5H4， 并且具體涉及胞內抗體3H2-1和5H4,其能夠直接或間接地分別靶向ABCF1家族的蛋白和 C120RF4家族的蛋白。本發明還涉及ABCF1和C120RF4抑制劑，其用于治療中的用途，尤其 是用于治療過敏和/或炎癥狀況。
[0002] 對與給定表型有關的細胞靶標的鑒定是更好地理解該表型潛在的細胞機制的基 本如提。具體而目，鑒定與醫療狀況有關的細胞革G標是制藥工業的巨大興趣所在，因為其使 得能夠設計新的治療，所述治療對這些靶標有效果，并能用于治療或診斷醫療狀況。細胞表 型可能經常與給定的病理學有關。因此，能夠允許對修飾細胞表型的分子進行鑒定的測定 (表型篩選）能對藥物設計有巨大幫助。對與給定表型有關的新細胞靶標的鑒定對其他行 業也是重要的，例如在化妝品中或在植物和食品工業中。
[0003] 理解已知或未知的細胞分子在給定表型中起的作用并不是件容易的事，這尤其是 因為細胞途徑是高度復雜的并且因為許多細胞內分子在若干不同的細胞途徑中起作用。因 此，使靶蛋白失活（例如通過RNA干擾）能對一些細胞途徑具有調節作用并且因此產生一 些伴隨的表型效應，所述表型效應可能彼此難以區分。此外，許多細胞蛋白能呈現不同的構 象和/或可以包含翻譯后修飾如磷酸化的氨基酸，并且因此可以與或不與另一個分子相互 作用，作為它們的構象的功能或翻譯后修飾的功能。因此，能夠允許對那些造成給定表型的 細胞靶標進行篩選，并且甚至對呈特定構象和/或經修飾的或未經修飾的狀態的靶標進行 篩選而不使這些細胞靶標完全失活的技術，對于更好地理解一些細胞途徑是具有極高價值 的工具。
[0004] 抗體可被視為精密工具，因為它們對它們的靶標是高度特異性的，并且能針對蛋 白的幾乎任何部分產生，并且尤其是針對較大的平面區域（蛋白相互作用常在此處發生， 并且其更難用小有機分子或肽靶向）產生。然而，天然抗體不適應于細胞內環境，因為它 們的尺寸大并且因為細胞質的還原環境阻止了二硫橋的形成，并因此阻止了抗體的適當折 疊。已經開發了重組抗體，其中包括scFv、雙抗體和sdAb，用于細胞內環境中的表達。將它 們稱為"細胞內抗體"或"胞內抗體"。
[0005] 發明人的團隊近期所描述的一個應用，是將根據其對靶抗體（或"Ab"）的調節效 果預先選出的胞內抗體用于篩選小分子文庫的用途（歐洲專利EP1743178B1)。其目的在于 分離出能模擬感興趣的scFv的細胞內作用并且可以體內使用的候選藥物。發明人將Ab的 這種ELISA置換應用在過敏模型中。同一團隊此前的工作已分離出了針對酪氨酸激酶Syk 的SH2結構域的scFv，所述結構域與肥大細胞激活的早期階段有關。已經顯示，這種scFv在 肥大細胞系中的細胞內表達抑制了由IgE受體激活所誘導的過敏遞質（mediator)的釋放， 而不干擾Syk的激酶活性（Dauvillier等，2002)。開發出了Ab置換測定（Abdisplacement assay)來分離抗-SykscFv的分子模擬物。以這個方式，對3000種分子的化學文庫進行篩 選，結果鑒定出了一種分子，指定為C-13。這種分子具有高抗過敏潛能，因為進一步的研究 證明了其在小鼠中體外抑制肥大細胞激活的能力以及體內抑制過敏性休克的能力（Mazuc等，2008)。通過結構分析和定向誘變還鑒定出了C-13與Syk相互作用的位點。在Syk的 兩個SH2結構域之間的界面處鑒定出的腔（cavity)被用于對500000種分子的文庫進行計 算機中的（insilico)第二次篩選。以這種方式，按照其抑制過敏遞質釋放的能力選出了 85種非酶的Syk抑制劑（Villoutreix等，2011)。
[0006]Inoue等（2011)描述了用隨機化的細胞內駱駝科動物VHH文庫進行的功能缺 失篩選。作者認為常規VH結構域在細胞內環境中是不可溶的。在相應的日本專利申請 JP2008-136455中，Inoue等的作者也認為scFvs在細胞內功能缺失篩選的背景下是無用 的，因為其細胞內穩定性和功能性低。
[0007] 發明人開發出了基于使用細胞內抗體（或"胞內抗體"）的新的表型篩選技術，用 于鑒定能對細胞途徑起作用并調節感興趣的表型的細胞靶標。本工作描述了首例用細胞內 人抗體片段在哺乳動物細胞中進行的表型選擇。
[0008] 發明人開發出的新方法允許鑒定與給定表型有關的細胞內靶標，并且尤其是未知 的細胞內靶標或已知的此前未與給定表型聯系在一起的靶標。發明人使用這項技術鑒定出 兩種RBL-2H3細胞克隆，稱為3H2和5H4,其分別表達抗體片段3H2-1和3H2-VH，以及5H4。 當在肥大細胞中表達時，這些抗體片段抑制脫顆粒反應，所述脫顆粒反應通常由過敏挑戰 而引發。發明人還鑒定出了兩種蛋白，ABCF1和L0C297607,它們分別能與3H2-1和5H4 - 起沉淀。發明人證明了L0C297607涉及肥大細胞脫顆粒，對于L0C297607現有技術中沒有 記載已知的功能。
[0009] 用于在蛋白質組規模實現表型篩選的細胞內Ab的選擇提供了諸多優勢。確實，當 在細胞中表達時，它們能干擾蛋白功能并進而產生給定的表型。此外，伴隨著它們的高親和 性和特異性特性，它們潛在地能夠靶向細胞中的任何分子，尤其是蛋白，以及更精確地說靶 向一些亞結構域或轉錄后修飾（其可能涉及具體的信號傳導）。在疾病模型的背景下，細胞 內抗體提供的另一個優點是，當它們的靶標被鑒定出來時，它們便能用于指導藥物開發。
[0010] 更具體而言，高多樣性的且針對細胞內表達進行優化后的組合的（combinatory) scFv文庫的使用，使發明人能進行大規模表型篩選。將這種篩選應用于肥大細胞激活的模 型，它們在這個信號傳導途徑中鑒定出了新的分子參與者（molecularplayer)。
[0011] 這個方法最初是用允許scFv文庫在肥大細胞系中表達的質粒系統開發出來的。 為了盡可能保持文庫的初始多樣性，選出了施行多拷貝表達模式的轉染條件。進行了表型 選擇，其導致呈現感興趣的表型且表達scFv的細胞富集，所述scFv抑制所研究的信號傳導 途徑。兩種具體抗體（Ab)片段3H2-1和5H4在肥大細胞系RBL-2H3中的表達，強烈抑制了 細胞釋放過敏遞質的能力。在產生它們以后，將這些抗體體外使用，以通過免疫沉淀實驗與 質譜法聯用來鑒定它們的蛋白靶標。蛋白ABCF1和L0C297607從而分別被鑒定為3H2-1和 5H4的靶標。
[0012]L0C297607(或"L0C"）是此前功能未知的蛋白，其似乎涉及經過FcεRI的肥大細 胞激活。的確，用shRNA的實驗的初步結果提示其干預對受體激活后的早期事件以及對過 敏遞質釋放的稍后事件的調控。在肥大細胞中通過評估干預由FcεRI介導的信號轉導的 蛋白的活性等來更精確地鑒定蛋白L0C的分子配偶體（partner)會是有趣的。
[0013] 此外，一些基因組數據提示蛋白L0C和炎癥之間的聯系。一項用染色體定位作圖 技術的研究通過在豬中的雜交輻射顯示了LOC的染色體基因座可能與炎癥有關，并且更具 體與特定形式的關節炎有關（Genini等，2006)。在Genebank中分析這個染色體基因座時， 發明人發現L0C基因與編碼蛋白酪氨酸磷酸酶PTPN6的基因共定位。此外，這種染色體共 定位在大鼠、小鼠和人之間是保守的。這個信息說明，這些蛋白可能涉及相同的信號傳導網 絡。的確，鑒定蛋白-蛋白相互作用的新方法是基于在不同物種間比較關聯蛋白序列之間 的染色體距離（Pazos和Valencia，2001)。
[0014] 為了將這種表型篩選方法最大化并擴大其范圍，發明人采用逆轉錄病毒系統對其 進行調整使之適應于scFv文庫的細胞內表達。與此前的質粒系統相比，這種表達模式使得 能夠對更廣泛的全部細胞類型進行轉染，并提供穩定表達，這使得能在更長的時期進行表 型研究。
[0015] 在質粒選擇期間，每個細胞表達了 2000-2500個scFv的拷貝，這使得在處理相對 小數量的細胞時能對多樣性廣泛的scFv進行探索。然而，每個細胞表達如此多scFv的事 實，施予了它們每一個之間在細胞內作用方面的強烈競爭，并因此可能維持高背景噪聲。就 這一點而言，每個細胞不超過3個拷貝的逆轉錄病毒文庫表達，具有降低選擇壓力的優點。 這些條件也使篩選能在更為生理學的條件中進行，在所述生理學的條件中蛋白網絡的完整 性不被過表達破壞。
[0016] 高通量測序分析揭示，在逆轉錄病毒選擇期間的每兩輪中包含再克隆步驟，使得 scFv更好地富集。來自同一個選擇（selection)且經過獨立分析的細胞克隆顯示出對 β-己糖胺酶脫顆粒作用的顯著抑制，這說明該選擇有效地允許抑制性的scFv富集。
[0017] 最后，使得對三個選擇能夠互相進行比較的主要數據，是在細胞刺激后膜聯蛋白V 標記的表型的演變（evolution)(圖26)。發明人發現包括了逆轉錄病毒再克隆步驟的選 擇使其朝著最明顯的抑制性表型收斂，因為其幾乎被被完全消除（92%抑制）。一個假說 是，在有再克隆的情況下，被選出的細胞群會在同時具有良好增殖和抑制性表型的克隆中 富集。這種假說能解釋兩個逆轉錄病毒選擇之間在朝著抑制性表型的收斂上的差異。
[0018] 本發明已證明了基于scFv的文庫能成功地用于表型的細胞內篩選。通過使用 scFvs的高多樣性文庫，基于具有細胞內穩定性的恒定框架，發明人成功發現并鑒定了針對 給定表型的未知的細胞內靶標，所述表型例如肥大細胞脫顆粒。
[0019] 發明人還發現，截短的scFv，包括胞內抗體3H2-VH、5H4-VH在細胞內環境中可以 是穩定且功能性的。具體而言，發現限定為完整VH結構域的胞內抗體5H4-VH在所述細胞 內環境中是穩定的，并且成功地抑制了肥大細胞脫顆粒。
[0020] 本發明第一個方面是用于鑒定涉及細胞表型的細胞靶標的方法，該方法包括：
[0021] a)鑒定胞內抗體，當其存在于細胞內時其能誘導、修飾或抑制所述表型；
[0022] b)鑒定細胞靶標，其是所述細胞中所述胞內抗體的直接或間接靶標；并任選地
[0023]c)分離所述細胞靶標。
[0024] 優選的胞內抗體包含免疫球蛋白的完整VH和/或Vj吉構域。
[0025] 抗體是識別蛋白，其能特異性地結合抗原上的獨特表位。抗體的抗原結合位點稱 為互補位。抗體屬于免疫球蛋白（Ig)類的蛋白。免疫球蛋白是一種蛋白家族，該家族的蛋 白的共同之處在于都有特異性的結構域，稱為"Ig_折疊"。最多的天然存在的抗體（或常 規抗體）是約150kDa的球蛋白，其包含兩條輕鏈（L)和兩條重鏈（H)通過二硫鍵連結在一 起。以沒有輕鏈為特征的非常規的抗體在駱駝科動物（camelid)和非軟骨魚類（如鯊魚） 中發現。輕鏈和重鏈包含恒定區（分別是Q和CH)和可變區（分別是\和￥》。在哺乳動 物中有5類Ig重鏈（α、δ、ε、γ、μ)，其長度為約450 - 550個氨基酸，以及2類Ig輕 鏈（κ、λ)，其長度為約210-220個氨基酸。Ig鏈由稱為"Ig域"的結構域組成。α、δ和 γ重鏈由一個可變結構域、三個恒定結構域和一個增加柔性的鉸鏈區組成。ε和μ重鏈 由一個可變結構域和四個恒定結構域組成。κ和λ輕鏈由一個可變結構域和一個恒定結 構域組成。Ig結構域通常具有約110個氨基酸。每個可變結構域包含高變區或環，其負責 表位結合，并被稱為互補決定區（CDR)，而CDRs之間的低變區稱為框架區。完整哺乳動物 VH和V#吉構域包含3個CDR，稱為CDR1、CDR2、和CDR3，以及4個框架區，稱為FR1、FR2、FR3 和FR4。相比之下，截短的VH和V#吉構域缺少⑶R中的至少一個或框架區中的至少一個， 例如通過在核苷酸序列內出現終止密碼子而編碼所述截短的VH和^結構域。類似地，截短 的scFv缺少VH和/或八結構域的CDR中的至少一個或框架區中的至少一個。截短的scFv 可能由單個的完整VH或八結構域組成。重鏈⑶R3是與抗原相互作用的主要貢獻者。所有 Ig結構域都具有特有的緊湊球狀結構，稱為"Ig-折疊"。Ig-折疊的結構是技術人員所熟 知的。簡言之，其由以希臘鑰匙拓撲結構排成兩個β-片層的7-9個反向平行β-鏈的兩 層夾心組成。其主干在兩個β-片層之間反復交替。典型地，其模式為（片層1中的Ν-末 端發夾）_(片層2中的β-發夾）-(片層1中的β-鏈）-(片層2中C-末端β-發 夾）。兩個片層也是通過二硫橋互相連接的。⑶R區形成環，其被保持于夾心結構的外 部。
[0026]常規抗體由木瓜蛋白酶消化產生三個片段：兩個Fab片段（抗原結合片段）和一 個Fc片段（可結晶片段）。Fab片段是一種結合到抗原的抗體區域。它約為50kDa且由每 條重鏈和輕鏈的一個恒定和一個可變結構域組成。兩個可變結構域（VJPVH)塑造形成了 抗原結合位點（互補位）。Fc區是抗體的尾部區域，其與細胞表面受體（Fc受體）相互作 用。常規抗體由胃蛋白酶消化產生兩個片段：F(ab'）2片段（抗原結合片段）和pFc'片段。 卩(&13'）2片段包含兩個抗原結合位點并可通過溫和的還原反應分裂為兩個Fab'片段。重鏈 和輕鏈可變區可以融合到一起形成單鏈可變片段（scFv)，其保留了Fab片段的特異性而僅 有其一半的大小（約25kDa)。scFv的\和VH結構域通常通過約15個氨基酸的短肽接頭 互相連接。所述接頭通常富含甘氨酸以具有柔性，以及富含絲氨酸或蘇氨酸以具有溶解性。 能通過將兩個或三個scFvs連接在一起從而設計出二價或三價的scFv。二價scFvs(雙抗 體的一種形式）是為人所感興趣的，因為它們對于它們的靶標具有非常高的親和性。單結 構域抗體（sdAb)是約12-15kDa的抗體，其由單個可變結構域（VJ^VH結構域）組成。例 如，sdAbs能由駱駝科動物VHH結構域、由常規抗體的VH或八結構域、或由重組VH或Vj吉構 域組成。scFv、雙抗體和sdAbs的一個優點是它們能被表達為單肽并能例如在細菌中產生 且在·菌體上展示。
[0027]根據本發明，K或"Ab"）是包含了免疫球蛋白的至少一個\或￥"結構域的 蛋白。
[0028]根據本發_，朐內抗體（或"細朐內抗體")是一種抗體，例如scFv、雙抗體和sdAb， 其適合在細胞內環境中使用。具體而言，所述抗體能在細胞胞質溶膠和/或核的還原條件 中折疊，并且在細胞內環境中是穩定的。胞內抗體能具體包含完整VH結構域、完整V#吉構 域、或二者皆有。胞內抗體能具體是scFv、包含至少一個完整VH或I結構域的截短的scFv、 雙抗體或是VH或八結構域。優選地，胞內抗體是scFv或包含至少一個完整VH或八結構域 的截短的scFv，最優選的是完整VH結構域。
[0029] 根據本發明并根據對術語的普遍理解（Muyldermans, 2001)，VHSV。結構域指的是 常規的VH或八結構域，即抗體的（而不是的駱駝科動物抗體的）VH或八結構域。就其他方 面而言，術語"VH結構域"不包括VHH片段，尤其是駱駝科動物VHH片段。因此，在本發明的一 個具體實施方案中，VH結構域和優選地結構域是非駱駝科動物抗體，或是來源于非駱駝 科動物抗體，優選為非駱駝科動物的哺乳動物抗體或是來源于非駱駝科動物的哺乳動物抗 體。在另一個實施方案中，VH和優選地V#吉構域不是非軟骨魚抗體或不是來源于非軟骨魚 抗體。
[0030] 常規VH或I結構域和駱駝科動物VHH之間的差異在許多序列和結構差異中找到 了基礎（Muyldermans，2001)。例如，駱駝VHH的⑶R1和⑶R2環采取的結構超出了針對常 規抗體的VH或^結構域所描述的標準結構。此外，VH結構域在其FR2區中包含4個標準 的疏水氨基酸，其參與了與\結構域的界面。在VHH中這些氨基酸都是突變的。這些突變， Val37Phe(或Tyr)、Gly44Glu(或Gin)、Leu45Arg(或Cys)和Trp47Gly(或Ser、Leu，或Phe) (Kabat編號，參考Kabat等，1991，以及Kontermann和DUbel, 2010)在胳盤抗體內是高度 保守的并且是將它們與常規VH結構域區分開的關鍵特征。相比于常規抗體的CDR3環（對 于人抗體是12個氨基酸，對于小鼠抗體是9個氨基酸），VHH抗體的CDR3環也更長（16-18 個氨基酸，通常對于駱駝VHH是17個）。
[0031] 已確認VHHs具有結合凹陷式抗原位點的能力，這是歸功于其較小的尺寸和其延 長的CDR3環穿入這些位點中的能力。然而，VHHs的單結構域性質對結合小抗原來說可能 是缺點，因為這些能結合到VH-\界面處的溝或腔中。
[0032] 在一個具體實施方案中，根據本發明的VH結構域包含如下氨基酸中一個或多個， 優選為全部：氨基酸V37、G44、L45和W47,參考Kabat編號方案。
[0033] 或者，根據本發明的VH結構域包含（優選為在FR2區中）基序VNNNNNNGLNW，其中 每個N是彼此獨立地選出的氨基酸，優選為選自遺傳密碼的20種標準氨基酸。
[0034] 此外，或者可替代地，根據本發明的VH結構域也能包含（優選為在FR2區中）基序 VNNNNNNGLNW的變體，其中每個N是氨基酸，其彼此獨立地選出，優選為選自遺傳密碼的20 種標準氨基酸，并且其中所述變體包含一個或多個，如1-2個或1-3個任何"N"氨基酸的氨 基酸添加，和/或一個或多個，如1-2個或1-3個任何"N"氨基酸的氨基酸缺失。
[0035] VH結構域和/或I結構域的⑶R3環優選地包含1-15個氨基酸，更優選為1-12個 氨基酸。
[0036] 不僅含有完整scFvs、還含有截短的scFvs的胞內抗體高多樣性文庫的使用，使得 能夠企及高多樣性的表位。雖然完整scFvs優選地與靶蛋白的表面或與小抗原相互作用， 但截短的scFvs，如sdAbs，因為它們的尺寸較小，更適合于與蛋白腔相互作用。因此完整 scFvs更適合于破壞蛋白-蛋白相互作用，而截短的scFvs，如sdAbs更適合于與其革巴抗原 上的小分子結合位點或酶位點相互作用。因此，在用于篩選未知靶標的文庫中存在兩種類 型的胞內抗體是高度有利的。
[0037] 在一個具體的實施方案中，胞內抗體包含來源于人抗體的\和/或VH結構域。更 優選地，胞內抗體是來源于人抗體的scFv、包含來源于人抗體的至少一個完整\或VH結構 域的截短的scFv、來源于人抗體的雙抗體或來源于人抗體的^或VH結構域。更普遍而言， 胞內抗體可以來源于人抗體。
[0038] 如此處所意指的，"來源于人抗體的\或VH結構域"表示與人免疫球蛋白的\^或 VH結構域完全相同或基本完全相同的八或VH結構域。"基本完全相同"意指所述八或VH結 構域可具有人免疫球蛋白的\或VH結構域，其中將修飾引入了一個或多個CDR區，優選為 引入CDR3區。也可以將修飾引入框架區，只要它們對\或VH結構域的細胞內折疊和/或 細胞內穩定性沒有不利影響的話。
[0039] 修飾能由一個或多個氨基酸的點突變、添加和/或缺失組成，例如1-20個氨基酸， 特別是1-15個氨基酸，更具體是1-12個氨基酸。當將修飾引入一個CDR區時，可以修飾 該CDR的一個至全部的氨基酸。優選地，引入修飾以具有與和經修飾的CDR或框架區相對 應的天然人CDRs或框架區中所觀察到的相同的氨基酸表現。還引入修飾，以使"來源于人 抗體的\或VH結構域"在使用下文所述用于評估抗體來源物種的測試時仍然被識別為人 的。在其他方面，當"來源于人抗體的\或￥"結構域"的序列與多種物種（包括人類（homo sapiens))的免疫球蛋白或其片段的文庫比對時，"最佳命中"對應于人免疫球蛋白或其片 段。
[0040] 如此處所意指，來源于人抗體的scFv包含來源于人抗體的\結構域和來源于人 抗體的VH結構域。類似地，來源于人抗體的雙抗體包含兩個來源于人抗體的sdAbs。
[0041] 若作適當變動（mutatismutandi)，術語"來源于特定物種或物種群體的抗體 的"（例如"來源非駱駝科動物抗體的"）應當以與"來源于人抗體的"相似的方式理解。
[0042] 在另一個實施方案中，胞內抗體包含人源化的\和/或VH結構域。更優選的是， 胞內抗體是人源化的scFv、包含至少一個完整人源化VJ^VH結構域的截短的scFv、人源化 的雙抗體或人源