包含pd-1抗原或pd-1配體抗原的病毒樣顆粒的制作方法
【專利說明】
[0001] 相關申請的交叉引用 本申請要求于2013年7月12日提交的美國臨時專利申請號61/845, 712的權益，所述 臨時專利申請的全部內容通過引用結合到本文中。
技術領域
[0002] 本發明涉及包含病毒結構蛋白和衍生自ro-i或ro-i配體的抗原的病毒樣顆粒， 以及包含該顆粒的組合物或藥盒、其在免疫應答中的用途等。
【背景技術】
[0003] 程序性細胞死亡1或ro-i(也稱為ro⑶1)為⑶28超家族的50-55kDa的I型 跨膜受體，其通過與特異性配體相互作用負調節T細胞抗原受體信號傳導，并且提示在自 身耐受的維持中發揮作用。
[0004] ro-ι抗原幾乎涉及免疫應答的每個方面，包括自身免疫、腫瘤免疫、感染免疫、移 植免疫、過敏和免疫赦免。
[0005] ro-i在活化T細胞、B細胞和巨噬細胞的表面上表達，（Y.Agata等人， InternationalImmunologyvol. 8，No. 5p765_772, 1996)提不與同樣在免疫系統中發 揮重要調節作用的CTLA-4相比，PD-1更廣泛地負調節免疫應答。
[0006] -般而言，存在對提供安全且有效的用于免疫病癥例如自身免疫疾病、炎癥性病 癥、過敏、移植排斥、癌癥、免疫缺陷和其它免疫系統-相關病癥的治療方法的需求。這些病 癥中牽涉的免疫應答調節可通過ro-i途徑的操縱完成。
[0007] PD-1具有兩種配體，PD-L1 (程序性死亡配體1或PD⑶L1或B7-H1)和PD-L2 (程 序性死亡配體2或⑶L2或B7-DC)，為B7家族配體的成員。
[0008] 在一種方法中，阻斷Η)-1及其配體（PD-L1、PD-L2或二者）的相互作用可為腫瘤 和病毒免疫療法提供有效的方式。
[0009] US5, 629, 204和US5, 698, 520涉及與人ro-i有關的膜蛋白和編碼所述蛋白的 dna，并且表明ro-i蛋白可用于治療各種感染、免疫抑制或加速或腫瘤等。
[0010] US7, 595, 048 和US2011/0081341 涉及以抑制PD-UPD-L1 或PD-L2 誘導的免疫 抑制信號為特征的免疫增強、用于癌癥或感染治療的組合物以及使用它們的療法。
[0011] 幾家大型制藥公司正在為搶先第一個進入市場而彼此競爭其ro-i抗體。此處為3 種單克隆抗體例如針對PD-1起作用的人源化單克隆IgG4抗體即Merck的Lambrolizumab (MK-3475)、完全的抗人PD-1 抗體即Bristol-MyersSquibb的Nivolumab(BMS-936558) 和不阻斷PD-1 而是阻斷PD-L1 的RocheGenentech的MPDL3280A。
[0012] 然而，仍強烈需要靶向ro-i的更強有效和安全的化合物。
[0013]病毒樣顆粒（VLP)為模仿真正的天然病毒的組織和構象但缺乏病毒基因組的多 蛋白結構，潛在地產生更安全和更便宜的候選疫苗。當前世界范圍內少數預防性的基于VLP 的疫苗已經商品化：GlaxoSmithKline的Engerix? (乙型肝炎病毒）和Cervarix? (人乳 頭瘤病毒）以及MerckandCo.，Inc的RecombivaxHB? (乙型肝炎病毒）和Gardasil? (人乳頭瘤病毒）為一些實例。其它基于VLP的候選疫苗在臨床試驗中或處于臨床前評估 中，例如，流感病毒、細小病毒、諾沃克（Norwalk)和多種嵌合VLP。許多其它VLP仍局限在 小規模基礎研究中，盡管其在臨床前測試中成功。大規模VLP生產的含意在過程控制、監 測和優化的背景下討論。相應地確定和討論了主要的上游和下游技術挑戰。伴隨最新的 臨床試驗結果和最近的基于嵌合VLP的技術的發展簡要介紹了成功的用于治療或預防接 種的基于VLP的重鎊炸彈疫苗（vaccineblockbuster)(ExpertRev.Vaccines9(10)， 1149-1176， 2010)。
[0014] 自從基孔肯雅病毒（Chikungunyavirus,CHIKV)在2004年從肯尼亞再度出現， 該甲病毒在非洲、歐洲和亞洲已經感染了數百萬人。在缺乏疫苗或抗病毒療法的情況下該 疾病的嚴重性和該流行性病毒的傳播呈現了一個嚴重的公眾健康威脅。據報道流行性基孔 肯雅病毒的VLP疫苗保護非人靈長類免受感染（NatMed. 2010March; 16(3): 334-338)。 美國專利出版號2012/0003266公開了包含一個或多個基孔肯雅病毒結構蛋白的可用于 配制誘導對感染或其至少一種癥狀的免疫的基孔肯雅疫苗或抗原組合物的病毒樣顆粒 (VLP)。W02012/106356公開了在甲病毒屬和黃病毒屬-介導的疾病的預防或治療中使用的 修飾的甲病毒屬或黃病毒屬病毒樣顆粒（VLP)和用于提高修飾的VLP的生產的方法。（這 些引用的參考文獻通過引用結合到本文中）。
[0015] 發明概述 在第一個方面，本發明提供包含病毒結構蛋白和選自衍生自ro-i的抗原和衍生自ro-i配體的抗原的抗原的顆粒。
[0016] 在第二個方面，本發明提供包含用于表達包含病毒結構蛋白和抗原的顆粒的核苷 酸序列的核酸分子，所述抗原選自衍生自ro-i的抗原和衍生自ro-i配體的抗原。
[0017] 在第三個方面，本發明提供一種藥物組合物和包含藥物組合物的藥盒，其中所述 藥物組合物包含含有病毒結構蛋白和選自衍生自ro-i的抗原和衍生自ro-i配體的抗原的 抗原的顆粒；或包含用于表達顆粒的核苷酸序列的核酸分子，所述顆粒包含病毒結構蛋白 和選自衍生自ro-i的抗原和衍生自ro-i配體的抗原的抗原；和藥學上可接受的載體。 [0018] 在第四個方面，本發明提供了包含病毒結構蛋白和選自衍生自ro-i的抗原和衍 生自ro-i配體的抗原的抗原的顆粒，或包含用于表達包含顆粒（其包含病毒結構蛋白和選 自衍生自ro-i的抗原和衍生自ro-i配體的抗原的抗原）的核苷酸序列的核酸分子用于制 造用于在受試者中調節免疫反應、治療癌癥或治療傳染病的藥物組合物或藥盒的用途。
[0019] 附圖簡述 圖1顯示ELISA的結果，其中檢測了與N端ro-1 (1-167aa)結合的抗體。
[0020] 圖2顯示ELISA的結果，其中檢測了與ro-1-Fc結合的抗體。
[0021] 實施方案的描述 (1)包含病毒結構蛋白和詵自衍牛自PD-1的抗原和衍牛自PD-1配體的抗原的抗原的 顆粒 在第一個方面，本發明提供包含病毒結構蛋白和選自衍生自ro-i的抗原和衍生自ro-i配體的抗原的抗原的顆粒。
[0022] 本發明還提供可通過調整上述顆粒制備的上述顆粒的衍生物。修飾的實例包括， 但不限于，一個或多個氨基酸殘基的添加、缺失或置換。
[0023] 本發明提供的顆粒可為由以下組成或包含以下的顆粒：i)至少一種病毒結構蛋 白和ii)至少一種衍生自ro-i的抗原或至少一種衍生自ro-i配體的抗原。所述至少一種 病毒結構蛋白可由一個或多個種類的蛋白或肽組成并自發組裝以形成本發明所提供的顆 粒。在一個實施方案中，本發明提供的顆粒具有至少10nm，例如，至少20nm，優選至少50 nm的直徑。在一個實施方案中，所述顆粒的分子量為100kDa- 100,000kDa，優選400kDa -30, 000kDa〇
[0024] 優選地，用于本發明的病毒結構蛋白可為從甲病毒屬或黃病毒屬衍生的病毒結構 蛋白。因此，本發明提供的顆粒可為病毒樣顆粒，包括從甲病毒屬或黃病毒屬衍生的病毒樣 顆粒。
[0025] 甲病毒屬和黃病毒屬的實例包括，但不限于，奧拉病毒（Auravirus)、巴班肯病 毒（Babankivirus)、巴馬森林病毒（BarmahForestvirus) (BFV)、比巴魯病毒（Bebaru virus)、卡巴斯歐病毒（Cabassouvirus)、基孔肯雅病毒（Chikungunyavirus) (CHIKV)、 東方馬腦炎病毒（Easternequineencephalitisvirus) (EEEV)、埃拉特病毒（Eilat virus)、沼澤地病毒（Evergladesvirus)、摩根堡病毒（FortMorganvirus)、蓋塔病毒 (Getahvirus)、高地J病毒（HighlandsJvirus)、孜拉加奇病毒（Kyzylagachvirus)、 馬亞羅病毒（Mayarovirus)、MeTri病毒、米德爾堡病毒（Middelburgvirus)、莫斯達 斯佩德拉斯病毒（MossodasPedrasvirus)、穆坎布病毒（Mucambovirus)、恩杜穆病毒 (Ndumuvirus)、歐尼恩病毒（0'nyong-nyongvirus)、那皮舒納病毒（Pixunavirus)、里奧 內格羅病毒（RioNegrovirus)、羅斯河病毒（RossRivervirus) (RRV)、鮭魚胰腺疾病 病毒（Salmonpancreasdiseasevirus)、西門利啟森林病毒（SemlikiForestvirus)、 辛德比斯病毒（Sindbisvirus)、南方象海豹病毒（Southernelephantsealvirus)、圖 那特病毒（Tonatevirus)、特羅卡拉病毒（Trocaravirus)、烏納病毒（Unavirus)、委內 瑞拉馬腦炎病毒（Venezuelanequineencephalitisvirus) (VEEV)、西方馬腦炎病毒 (Westernequineencephalitisvirus) (WEEV)、瓦塔羅阿病毒（Whataroavirus)、西尼 羅河病毒（WestNilevirus)、登革熱病毒（denguevirus)、蜱傳腦炎病毒（tick-borne encephalitisvirus)和黃熱病毒（yellowfevervirus) 〇
[0026] 病毒結構蛋白可為衣殼蛋白、包膜蛋白、其片段或其復合體。因此，用于本發明的 病毒結構蛋白可由衣殼蛋白和/或包膜蛋白和/或其片段組成或包含衣殼蛋白和/或包膜 蛋白和/或其片段。在一個實施方案中，本發明提供的病毒樣顆粒由衣殼、E2和E1組成或 包含衣殼、E2和E1。可將抗原插入E2中。例如，本發明提供的病毒樣顆粒可通過組裝240 個衣殼、240個E1蛋白和240個E2蛋白形成，其中Η)-1抗原插入每個E2蛋白中。
[0027] 如本文所使用的，術語"ro-i抗原"是指從ro-i衍生的抗原。優選地，ro-i為人 pd-1。衍生自ro-i的抗原可為ro-i的片段或ro-i片段的衍生物。
[0028] 如本文所使用的，術語"ro-i配體抗原"是指從ro-i的配體衍生的抗原。ro-i的 配體的實例包括，但不限于，pd-li和ro-L2。優選地，PD-1的配體為人ro-Ll或人ro-L2。 衍生自PD-L1的抗原可為ro-Li或ro-L2的片段；或ro-Li或ro-L2的片段的衍生物。 [0029] 用于在本發明提供的顆粒所包含的抗原中使用的ro-i、PD-L1或ro-L2的片段可 基于ro-i、PD-L1或ro-L2的氨基酸序列和/或其三級結構選擇。
[0030] 例如，用于在抗原中使用的片段可由位于ro-l、PD-Ll或ro-L2