蛋白質的制造方法
【專利說明】蛋白質的制造方法 【技術領域】
[0001 ] 本申請涉及用于使重組細胞中的自外來性基因的蛋白質的表達亢進的重組細胞、 以及涉及利用那樣的細胞的發明。更具體涉及，利用使P180蛋白質的表達、及/或SF3b4 蛋白質的表達均亢進的細胞、或者有這樣的特征的細胞，使作為目的物的蛋白質的合成能 力或分泌能力亢進，作為結果提供制造蛋白質的方法。利用有上述特征的細胞，使作為目的 物的蛋白質的合成能力或分泌能力亢進，在作為其結果制造蛋白質的方法中，在用于作為 目的物的蛋白質表達的載體中利用順式-元件也作為另外的特征。 【【背景技術】】
[0002] 應用基因重組技術的生物技術藥品，近年、特別在抗體藥品市場急速擴大，向其醫 療費的負荷也變得危險，常常要求可相比以往更有效進行蛋白質生產，成本更低的生物技 術藥品的制造技術的開發。
[0003] 作為用于利用基因重組技術的蛋白質生產的宿主，至今利用，動物細胞、酵母、大 腸桿菌等。大腸桿菌等可以低成本生產作為目的物的蛋白質，但無法進行糖鏈修飾等的翻 譯后修飾，在糖蛋白質的生產不適宜。另外，大腸桿菌有易制作含生產的蛋白質的包含體的 性質，在作為目的物的蛋白質的取得中，合成后，進一步增溶過程變得必要，存在作業負荷 尚的缺點。
[0004] 特別是，抗體等的糖蛋白質的情況中，附加的糖鏈由于對作為目的物的蛋白質的 水溶性、對蛋白酶的抵抗性、組織目標性、還有其生物活性也有影響，必要使用作為高等真 核生物的動物細胞的生產技術，近年其技術大大進步。那樣的狀況的原來、現在的抗體藥品 的多數在中國倉鼠卵巢（CH0)細胞中生產，但其制造過程的優化依然是重要的課題。
[0005] 從含哺乳動物細胞的真核生物細胞向細胞外分泌的蛋白質在作為被內膜隔開的 細胞器的小胞體中合成。小胞體被大分為在表面具有由RNA-蛋白質的巨大復合物組成的 蛋白質合成裝置的核糖體的粗面小胞體和無核糖體的滑面小胞體的2種，但不知粗面小胞 體的詳細的形成結構。
[0006] 在活體內，存在專門從事特定的蛋白質的分泌的專門分泌細胞（professiona1 secretorycells)，在它們的細胞中粗面小胞體顯著地發達，被認為可進行高效率的蛋白 質生產。例如分泌膠原的成纖維細胞、分泌消化酶組的胰腺線房外分泌細胞等對應于那樣 的專門分泌細胞。與這些的專門分泌細胞比較，多用于現在基因工程學蛋白質生產的CH0 細胞、HEK293細胞等有粗面小胞體非常地少量，分泌活性低的問題。
[0007] 在利用基因重組技術生產生物技術藥品時，作為目的物的蛋白質的基因在表達載 體中顯示高的轉錄活性的啟動子的控制化，預計其mRNA以高水平表達。但是，即使置于那 樣的狀況下，也屢屢發生mRNA水平和蛋白質表達量本身不相關的情況，作為其一原因可舉 在小胞體膜上的翻譯效率的低。
[0008] 即認為，在多用于現在這些的基因工程學蛋白質生產的細胞中，只要可對于在小 胞體膜上的翻譯裝置易利用的形式提供mRNA，就與成纖維細胞的情況同樣地，留有可越發 增強蛋白質合成能力的余地。
[0009] 在恒定分泌膠原的成纖維細胞中，編碼膠原蛋白質的mRNA時常高水平表達，其大 部分在分泌蛋白質的生物合成的場所的小胞體膜上被檢測（非專利文獻1)。但是，為了使 膠原合成活化，僅在小胞體上存在其mRNA是不充分的，使翻譯效率高的多核糖體形成變得 必要。
[0010] 由發明人的至今的解析知，在膠原基因等的一部分的蛋白質的mRNA中，具備易形 成附著多個作為蛋白質合成裝置的核糖體的多核糖體的性質（專利文獻1、非專利文獻2)。 從這些推測可能是，在利用基因重組技術生產生物技術藥品時，無關于編碼目的蛋白質的 基因轉錄產物高水平表達，發生其蛋白質合成/分泌量低的問題是在利用的細胞中mRNA無 法以易在小胞體膜上的翻譯裝置中利用的形式提供。
[0011] 【現有技術文獻】
[0012] 【非專利文獻】
[0013] 非專利文獻l:Ueno,T.，etal.，（2010).JBiolChem285(39)，29941-50。
[0014] 非專利文獻 2:Ueno,T.，etal.，（2012) ·Regulationofpolysomeassemblyon theendoplasmicreticulumbyacoiled-coilprotein,pl80.NucleicAcidsRes。
[0015] 【專利文獻】
[0016] 專利文獻 1:特愿 2011-227462 【
【發明內容】
】
[0017]【發明要解決的技術課題】
[0018] 小胞體中的蛋白質合成中，向小胞體的mRNA的定位（多核糖體形成）是必須的。 為了再高效率的蛋白質合成，多數的核糖體附著于mRNA的多核糖體形成的促進被認為是 非常地有效的，但不知P180蛋白質的多核糖體形成的促進功能的結構。
[0019] 【解決課題的技術方案】
[0020] 本申請的發明人進行詳細的解析的結果新發現，與作為pl80蛋白質的多核糖體 形成促進功能的責任區域的卷曲螺旋結構域（非專利文獻2)特異性地相互作用，促進mRNA 的小胞體（ER)定位的蛋白質、剪接因子3B亞基4(SF3b4)蛋白質。然后，在制出高表達 SF3b4蛋白質和pl80蛋白質的兩方的細胞時，在有這樣的特征的細胞中，mRNA的向小胞體 上的定位顯著地升高，知可使培養細胞的分泌功能升高變得可能。結果，完成本申請發明。
[0021] 本發明的發明人顯示可提供，在細胞中，促進pl80蛋白質的全長或其部分的表 達、然后mRNA的小胞體（ER)定位的蛋白質的表達亢進，在細胞內的作為目的物的蛋白質的 合成能力或分泌能力亢進的重組細胞。
[0022] 本發明的發明人另外顯示，可在本發明的第2實施方式中，使pl80蛋白質的全長 或其部分的表達亢進，然后在使促進mRNA的小胞體（ER)定位的蛋白質的表達亢進的重組 細胞中，通過轉化編碼作為目的物的蛋白質的核酸分子或使作為目的物的蛋白質的產生量 增加，可使作為目的物的蛋白質的合成能力或分泌能力亢進，作為結果提供制造蛋白質的 方法。
[0023] 在本發明中提供這樣的特征性的重組細胞，或者利用那樣的特征性的重組細胞， 顯示通過使作為目的物的蛋白質的合成能力或分泌能力亢進，可解決上述的課題。
[0024] [1]在細胞中，促進pl80蛋白質的全長或其部分的表達、mRNA的小胞體（ER)定位 的蛋白質的表達、或者這兩方的表達均亢進，在細胞內的作為目的物的蛋白質的合成能力 或分泌能力亢進的重組細胞。
[0025] [2] [1]所述的重組細胞，其中pl80蛋白質選自：
[0026] (a)由與人來源的pl80蛋白質的氨基酸序列（SEQIDN0:2)有至少70%的序列相 同性的氨基酸序列組成，有促進細胞內的在小胞體膜上的多核糖體形成的功能的蛋白質、
[0027] (b)由在人來源的pl80蛋白質的氨基酸序列（SEQIDN0:2)中缺失、取代、或者附 加1個或數個氨基酸的氨基酸序列組成，有促進細胞內的在小胞體膜上的多核糖體形成的 功能的蛋白質、
[0028] (c)由與編碼人來源的pl80蛋白質的基因的核苷酸序列（SEQIDNO: 1)有至少 70%的序列相同性的核苷酸序列所規定的氨基酸序列組成，有促進細胞內的在小胞體膜上 的多核糖體形成的功能的蛋白質、
[0029] ⑷由在編碼人來源的pl80蛋白質的基因的核苷酸序列（SEQIDNO: 1)中缺失、 取代、或者附加1個或數個核苷酸的核苷酸序列所規定的氨基酸序列組成，有促進細胞內 的在小胞體膜上的多核糖體形成的功能的蛋白質、及
[0030] (e)由可和與編碼人來源的P180蛋白質的基因的核苷酸序列（SEQIDNO: 1)互補 的核苷酸序列在嚴格的條件下雜交的核苷酸序列所規定的氨基酸序列組成，有促進細胞內 的在小胞體膜上的多核糖體形成的功能的蛋白質。
[0031] [3] [1]或[2]所述的重組細胞，其中pl80蛋白質是哺乳動物來源的。
[0032] [4] [3]所述的重組細胞，其中哺乳動物的pl80蛋白質的全長或其部分是人 P180 蛋白質（SEQIDN0:2)、小鼠pl80 蛋白質（GenBank登錄號No.NP_077243)、大鼠 P180蛋白質（GenBank登錄號No.XP_230637)、中國倉鼠pl80蛋白質（GenBank登錄號 No.XM_003496471)、狗pl80 蛋白質（GenBank登錄號No.NP_001003179)、馬pl80 蛋白質 (GenBank登錄號No.XP_001915027)、猴pl80 蛋白質（GenBank登錄號No.XP_002798281)、 黑猩猩pl80蛋白質（GenBank登錄號No.XP_514527)、豬pl80蛋白質（GenBank登錄號 No.XP_001926148)、或者它們的部分。
[0033] [5] [1]~[4]之任一項所述的重組細胞，其中pl80蛋白質的部分選自，含對應于 由有SEQIDN0:2所示的氨基酸序列的蛋白質（人pl80蛋白質）的第27~157氨基酸組 成的區域的氨基酸序列的部分、含對應于由第623~737氨基酸組成的區域的氨基酸序列 的部分、含對應于由第738~944氨基酸組成的區域的氨基酸序列的部分、含對應于由第 945~1540氨基酸組成的區域的氨基酸序列的部分。
[0034] [6] [1]~[5]之任一項所述的重組細胞，其中促進mRNA的小胞體（ER)定位的蛋 白質，自剪接因子3B亞基4(SF3b4)蛋白質的全長或其部分（SEQIDN0:4的全長氨基酸序 列 424AA;作為RRM1 的SEQIDN0:4 的 13 ~91AA;作為.RRM2 的SEQIDN0:4 的 100,。
[0035] [7] [6]之任一項所述的重組細胞，其中SF3b4蛋白質選自
[0036] ⑴由與人來源的SF3b4蛋白質的氨基酸序列（SEQIDN0:4)有至少70%的序列 相同性的氨基酸序列組成，有促進mRNA的向小胞體的定位的功能的蛋白質、
[0037] (ii)由在人來源的SF3b4蛋白質的氨基酸序列（SEQIDN0:4)中缺失、取代、或 者附加1個或數個氨基酸的氨基酸序列組成，有促進mRNA的向小胞體的定位的功能的蛋白 質、
[0038] (iii)由與編碼人來源的SF3b4蛋白質的基因的核苷酸序列（SEQIDN0:3)有至 少70%的序列相同性的核苷酸序列所規定的氨基酸序列組成，有促進mRNA的向小胞體的 定位的功能的蛋白質、
[0039] (iv)由在編碼人來源的SF3b4蛋白質的基因的核苷酸序列（SEQIDN0:3)中缺 失、取代、或者附加1個或數個核苷酸的核苷酸序列所規定的氨基酸序列組成，有促進mRNA 的向小胞體的定位的功能的蛋白質、
[0040] (V)由可和與編碼人來源的SF3b4蛋白質的基因的核苷酸序列（SEQIDN0:3)互 補的核苷酸序列在嚴格的條件下雜交的核苷酸序列所規定的氨基酸序列組成，有促進mRNA 的向小胞體的定位的功能的蛋白質。
[0041] [8] [6]或[7]所述的重組細胞，其中SF3b4蛋白質是哺乳動物來源的。
[0042] [9] [8]所述的重組細胞，其中哺乳動物的SF3b4蛋白質的全長或其部分是人 SF3b4 蛋白質（SEQIDN0:4)、小鼠SF3b4 蛋白質（GenBank登錄號No.NP_694693. 1)、大 鼠SF3b4 蛋白質（GenBank登錄號No.ΝΡ_001011951· 1)、中國倉鼠SF3b4 蛋白質（GenBank 登錄號No.ΧΡ_003498680· 1)、狗SF3b4 蛋白質（GenBank登錄號No.ΧΡ_540295· 3)、馬 SF3b4 蛋白質（GenBank登錄號No.ΧΡ_001488649. 2)、猴SF3b4 蛋白質（GenBank登錄號 No.NP_001097793. 1)、黑猩猩SF3b4 蛋白質（GenBank登錄號No.XP_513768. 2)、豬SF3b4 蛋 白質（GenBank登錄號No.ΧΡ_001926524. 1)、或者它們的部分。
[0043] [10] [1]~[9]之任一項所述的重組細胞，其中作為目的物的蛋白質的合成能力 或分泌能力通過轉化編碼作為目的物的蛋白質的核酸分子或使作為目的物的蛋白質的產 生量增加亢進。
[0044] [11]細胞株，其由保藏號NITEBP-01753(CH0 3D5)、保藏號NITEBP-01535(CH0 YA7)、或者保藏號NITEABP-01811(CH01B2)表示。
[0045] [12]制造作為目的物的蛋白質的方法，其使pl80蛋白質的全長或其部分的表達 充進，使促進mRNA的小胞體（ER)定位的蛋白質的表達充進，或在使這些蛋白質兩方的表達 亢進的重組細胞中，通過轉化編碼作為目的物的蛋白質的核酸分子或使作為目的物的蛋白 質的產生量增加。
[0046] [13] [12]所述的方法，其中pl80蛋白質是哺乳動物來源的。
[0047] [14] [13]所述的方法，其中哺乳動物的pl80蛋白質的全長或其部分是人 P180 蛋白質（SEQIDN0:2)、小鼠pl80 蛋白質（GenBank登錄號No.NP_077243)、大鼠 P180蛋白質（GenBank登錄號No.XP_230637)、中國倉鼠pl80蛋白質（GenBank登錄號 No.XM_003496471)、狗pl80 蛋白質（GenBank登錄號No.NP_001003179)、馬pl80 蛋白質 (GenBank登錄號No.XP_001915027)、猴pl80 蛋白質（GenBank登錄號No.XP_002798281)、 黑猩猩pl80蛋白質（GenBank登錄號No.XP_514527)、豬pl80蛋白質（GenBank登錄號 No.XP_001926148)、或者它們的部分。
[0048][15] [13]或[14]所述的方法，其中哺乳動物的pl80蛋白質的部分選自，含由有 SEQIDN0:2所示的氨基酸序列的蛋白質（人pl80蛋白質）的第27~157氨基酸組成的 區域的部分、含由第623~737氨基酸組成的區域的部分、含由第738~944氨基酸組成的 區域的部分、含由第945~1540氨基酸組成的區域的部分。
[0049] [16] [12]~[15]之任一項所述的方法，其中促進mRNA的小胞體（ER)定位的蛋 白質汾，選自剪接因子3B亞基4 (SF3b4)蛋白質的全長或其部分（SEQIDN0:4的全長氨基 酸序列 424AA;作為RRM1 的SEQIDN0:4 的 13 ~91AA;作為·RRM2 的SEQIDN0:4 的 100〇
[0050] [17] [16]所述的方法，其中SF3b4蛋白質是哺乳動物來源的。
[0051] [18] [17]所述的方法，其中哺乳動物的SF3b4蛋白質的全長或其部分是人SF3b4 蛋白質（SEQIDN0:4)、小鼠SF3b4 蛋白質（GenBank登錄號No.NP_694693. 1)、大鼠 SF3b4 蛋白質（GenBank登錄號No.ΝΡ_001011951· 1)、中國倉鼠SF3b4 蛋白質（GenBank 登錄號No.ΧΡ_003498680· 1)、狗SF3b4 蛋白質（GenBank登錄號No.ΧΡ_540295· 3)、馬 SF3b4 蛋白質（GenBank登錄號No.ΧΡ_001488649. 2)、猴SF3b4 蛋白質（GenBank登錄號 No.NP_001097793. 1)、黑猩猩SF3b4 蛋白質（GenBank登錄號No.XP_513768. 2)、豬SF3b4 蛋 白質（GenBank登錄號No.XP_001926524. 1)、或者它們的部分。
[0052] [19] [12]~[18]之任一項所述的方法，其中重組細胞是由保藏號NITE BP-01753 (CH0 3D5)、保藏號NITEBP-01535 (CH0YA7)、或者保藏號NITEABP-01811(CH0 1B2)表示的細胞株。
[0053] [20] [12]~[19]之任一項所述的方法，其中作為目的物的蛋白質是糖蛋白質。
[0054] [21] [20]所述的方法，其中作為目的物的蛋白質是膠原、纖連蛋白或抗體。
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