干擾素α和ω抗體拮抗劑的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及廣泛中和的干擾素-α和干擾素-ω抗體拮抗劑，編碼抗體或片段的 多核苷酸、以及制造和使用上述物質的方法。
【背景技術】
[0002]I型IFN是一類細胞因子，該細胞因子均通過遍在表達的異二聚體受體（IFNAR)進 行信號傳導，從而產生抗病毒、抗增殖和免疫調節的效應。在人體中，I型IFN由至少12個 IFNa蛋白亞型以及IFN0、IFNε、IFNk和IFNco各一個亞型進一步結合。I型IFN的誘 導響應于無菌和微生物配體而發生。盡管I型IFN的抗病毒和抗增殖效果已經在臨床中用 于治療感染性疾病和腫瘤適應癥，但I型IFN的拮抗劑正被開發以用于免疫介導的炎性適 應癥。
[0003] 許多免疫介導的炎性疾病，諸如SLE、I型糖尿病、牛皮癬、原發性干燥病、系統性 硬化病和類風濕性關節炎，均證明I型IFN可升高到不同的程度，如通過存在于全血和/或 組織中的通常稱為IFN-特征的IFN誘導基因轉錄物的過量所確定。
[0004]目前用于狼瘡的臨床開發的I型IFN拮抗劑方法包括使用抗IFN a抗體中和 IFNa亞型而非其他I型IFN(i3，ε，κ，ω)的多種方法，所述抗體諸如在以下專利中所述 的那些：美國專利7, 087, 726、美國專利8, 025, 882和美國專利申請公布US2008/0160030。 臨床實驗數據表明，用抗IFN a抗體治療過的患者中I型IFN特征部分減少（Merrill等人， AnnRheumDis70:1905-1913, 2011;Yao等人，ArthritisRheum60:1785-1796,2009)， 并且在干擾素特征度量標準（ISM)-低中到嚴重活性狼瘡受試者的預先指定的生物標記 定義組中，在第24周，SLE的病征和癥狀、發斑速率和類固醇負擔均得以改善。在預定義 為ISM高的患者中沒有觀察到任何功效（Kalunian等人，2012ACR/ARHPAnnualMeeting; Abstract#2622,2012)〇
[0005] 抗IFNAR1抗體是治療狼瘡的另一個選擇（Wang等人，2013;Clinical Pharmacology&Therapeuticsacceptedarticlepreview14February2013 ； doi:10. 1038/clpt.2013.35)。IFNAR1 阻斷預計將破壞由所有I型IFN(包括IFN0) 誘導的IFN信號傳導。由于編碼IFNi3的基因的特異性缺失引發病毒宿主相比于相似 暴露的具有功能性IFNβ的小鼠而目易感性顯者，所以IFNβ可在抗病毒防御中發揮 更關鍵的作用（Lazear等人，JVirol85:7186-7194, 2011;Deonarain等人，JVirol 74:3404-340, 2000;Deonarain等人，Circulation110:3540-3543, 2004;Gerlach等人，J Virol80:3438-3444, 2006)〇
[0006]因此，需要另外的抗體來治療狼瘡和其他免疫介導的炎性疾病。
【附圖說明】
[0007] 圖1示出了由圖lA)100U/ml內源白細胞IFN(病毒誘導）或圖lB)250U/ml重組 人IFNco在特定濃度下誘導的對全血中IP-10釋放的抑制。
[0008] 圖2示出了對I型IFN的抑制，該抑制是由來自系統性紅斑狼瘡（SLE)患者的免 疫復合物誘導的，該復合物由所示的不同抗體構成。與單獨的抗IFNa抗體相比，抗IFNa1 和抗IFNω的組合、抗IFNa2和抗IFNω的組合、或抗IFNa3和抗IFNω的組合提供更顯 著的抑制。廣泛中和抗IFNa/IFNco抗體（Μ43)顯示出對總活性的進一步抑制。
[0009]圖3示出了使用抗IFNco、抗IFNa抗體或兩者的組合，升高的SLE基因特征的抑 制百分比（％)。將未經抗體處理的情況下基線升高的IFN誘導基因表達歸一化為100%。
[0010] 圖4示出了IFNco /FabM43復合物的總體分子結構。標記為Η的是VH;標記為L的 是VL，左上方是IFNco。
[0011] 圖5示出了圖5A)的IFNa4A/Fab357復合物和圖5B)的IFNω/Fab357復合物的 總體分子結構。對于Fab僅示出Fv部分。Fab537是C2595的Fab。
[0012] 圖6A)示出了IFNa4A/FabM88復合物的總體分子結構。圖6B)示出圍繞抗原結 合位點的表位區域的一部分的代表性電子密度（2mF〇-DFc為1. 5σ)。標記為Η的是VH;標 記為L的是VL;左上方是IFNα4Α。
[0013] 圖7示出了IFNa4Α的結構及其與IFNco和IFNa的比較。圖7Α)示出了IFNa4Α。 標記了五個主要的螺旋。還標記了緊挨著短螺旋片段的長連接環AB。圖7B)示出了 IFNco(pdb代碼 3se4)并且圖 7C)示出了IFN0(pdbidlaul)。圖 7D)示出了與IFN0 的 結構比對。橢圓框表示AB螺旋片段周圍的主要差異。
[0014]圖 8.通過M88 中和的模式。IFNco/IFNARl/IFNAR2 結構（pdbid3se4)和M88/ IFNa4在IFN上重疊。
【發明內容】
[0015] 本發明的一個方面是分離的單克隆抗體，該單克隆抗體結合至人干擾素 ω(IFNco)和至少四種、五種、六種、七種、八種、九種或十種人干擾素a(IFNa)亞型并中 和其活性。
[0016] 在本發明的其他方面，該分離的抗體競爭結合到人IFNco和人IFNa亞型 IFNaB2、IFNaF、IFNaG和/或IFNaJ1上，其中所述分離的抗體包含：
[0017]SEQIDN0:23的重鏈可變區（VH)氨基酸序列和SEQIDN0:24的輕鏈
[0018] 可變區（VL)氨基酸序列；或
[0019]SEQID N0:27的VH氨基酸序列和SEQID N0:28的VL氨基酸序列。
[0020]
[0021] 在本發明的另外方面，該分離的抗體在SEQIDN0:1的一個或多個殘基F27、L30 和R33處結合IFNc〇4a;該分離的抗體在SEQIDN0:19的一個或多個殘基F27、L30和R33 處結合至IFNa4a;該分離的抗體抑制系統性紅斑狼瘡（SLE)免疫復合物誘導的IFN的活 性。
[0022] 本發明的另外的方面是編碼本發明的抗體的分離的多核苷酸以及藥物組合物，該 藥物組合物包含本發明的抗體和藥學上可接受的載體。
[0023] 本發明的另一方面是一種治療或預防與IFNα和IFNco生成增加相關聯的疾病的 方法，該方法包括將治療有效量的本發明的分離抗體向對其有需求的患者施用足以治療或 預防該疾病的時間。在本發明的一個另外的方面，與IFNa和IFNco生成增加相關聯的疾 病是系統性紅斑狼瘡（SLE)。
[0024] 本發明的另一方面是在對其有需求的患者體內抑制IFNco和IFNa亞型IFNaB2、 IFNaF、IFNaG和/或IFNaJ1與IFNAR的相互作用的方法，該方法包括將本發明的分離 抗體向患者施用足以預防IFNco和IFNa亞型IFNaB2、IFNaC、IFNaF、IFNaG和/或 IFNaJ1與IFNAR的相互作用的時間。
【具體實施方式】
[0025] 本說明書中所引用的所有出版物（包括但不限于專利和專利申請）均以引用方式 并入本文，如同在本文中完整給出。
[0026] 應當了解，本文所用的術語只是為了描述具體實施例的目的，并非旨在進行限制。 除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語的含義與本發明所屬領域的普通技術 人員通常所理解的含義相同。
[0027] 雖然與本文所述的那些方法和材料相似或等效的任意方法和材料都可以用于檢 驗本發明的實踐中，然而本文中描述示例性材料和方法。在描述和要求保護本發明時，將使 用以下術語。
[0028] 如本文所用，術語"特異性結合"或"特異性地結合"或"結合"是指抗體以比針對 其他抗原更高的親和力結合于預定的抗原。通常，抗體以1X10 7M或更小，例如1X10SM或更小、1X10 9M或更小、1X10 或更小、1X10nM或更小、或1X10 12M或更小的解離常 數（KD)結合于預定的抗原，通常KD為其結合至非特異性抗原或表位（例如BSA、酪蛋白） 的KD的至少十倍。可以使用標準程序來測量解離常數。然而，特異性結合至預定抗原的抗 體可能對其他相關的抗原具有交叉反應性，例如對于來自其他物種（同源）的相同預定抗 原，諸如人或猴，例如食蟹獼猴（Macacafascicularis) (cynomolgus，cyno)或黑猩猩（Pan troglodytes) (chimpanzee,chimp)具有交叉反應性。特異性結合至預先確定的抗原的抗體 可進一步結合在兩個或多個不同抗原諸如干擾素a(IFNa)和干擾素ω(IFNco)之間共享 的表位；即抗體與IFNa和IFNco交叉反應。
[0029] 如本文所用，術語"中和"或"中和抗體"或"抗體拮抗劑"意指通過任意機制部分 抑制或完全抑制干擾素a(IFNa)和/或干擾素ω(IFNco)的生物活性的抗體或抗體片 段。中和抗體可使用如下所述對IFNa和/或IFNco的生物活性的測定來鑒定。IFNa和/ 或正~〇中和抗體可使所測量的正~€1和/或正~〇生物活性抑制20%、30%、40%、50%、 60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%。
[0030] 如本文所用，術語"干擾素-a "(IFNa)意指人a干擾素的所有天然亞型。天然的 IFNa由多于23種緊密相關的蛋白亞型組成，這些蛋白亞型由具有高度結構同源性的不同 基因編碼（Weissmann和Weber，Prog. Nucl. Acid. Res. Mol. Biol.，33:251，1986 ;Roberts等 人，J. Interferon Cytokine Res. 18:805-816, 1998)。人IFN α亞型為至少IFN a A (IFN a 2) (SEQ ID N0:5)、IFNaB2(IFNa8)(SEQ ID NO:6)、IFNaC(IFNal〇)(SEQ ID N0:7)、 IFNa D (IFNa 1) (SEQ ID NO: 8) ^ IFN a F (IFN a 21) (SEQ ID NO: 9) ^ IFN a G (IFN a 5) (SEQ ID NO :10)和IFNa H (IFN a 14) (SEQ ID NO: 11)、具有P34H取代的IFN a I (IFN a 17) (SEQ ID NO: 12)、IFNa J1 (IFNa 7) (SEQ ID NO: 14)、IFNa K(IFNa 6) (SEQ ID NO: 14)、 IFN a 4b (IFN a 4) (SEQ ID NO: 15)和IFNa WA (IFN a 6) (SEQ ID NO: 16)。人干擾素的命名 詳見：http: //www_genenames_org/genefami1ies/_IFN〇
[0031] 如本文所用的，術語IFNco意指具有一定氨基酸序列的人IFNco，該氨基酸序列如 SEQIDNO: 1 和UniProt登錄號P05000 所示。
[0032] 術語"I型干擾素"意指人干擾素_α的所有天然亞型以及干擾素、干擾素-ε、 干擾素_ω和干擾素-κ的一個亞型，這些干擾素都結合至通用干擾素受體IFNAR上。
[0033] 如本文所用，術語"IFNAR"意指熟知的異二聚體干擾素受體，S卩IFNAR1和IFNAR2。 IFNAR1和IFNAR2蛋白序列分別如SEQIDN0:31和SEQIDN0:32所示。IFNAR1成熟的胞 外域跨SEQIDN0:31的第28-436位殘基，而IFNAR2成熟的胞外域跨SEQIDN0:32的第 27-243位殘基。
[0034] 如本文所用，術語"抗體"含義廣泛且包括：免疫球蛋白分子，包括多克隆抗體；單 克隆抗體，包括鼠、人、人適應性、人源化和嵌合單克隆抗體；抗體片段；由至少兩個完整抗 體或抗體片段所形成的雙特異性或多特異性抗體；二聚體、四聚體或多聚體抗體；以及單 鏈抗體。
[0035] 免疫球蛋白可根據重鏈恒定域氨基酸序列被指定為五種主要種類，即IgA、IgD、 IgE、IgG和IgM。IgA和IgG進一步亞分類為同種型IgApIgArlgGpIgGpIgG；^IgG4。任 何脊椎動物物種的抗體輕鏈可基于其恒定域的氨基酸序列被指定至兩種明顯不同類型中 的之一，即κ(κ)和λ(λ)。
[0036] 術語"抗體片段"是指免疫球蛋白分子的一部分，其保留重鏈和/或輕鏈抗原結合 位點，諸如重鏈互補決定區（HCDR)1、2和3,輕鏈互補決定區（IXDR)1、2和3,重鏈可變區 (VH)或輕鏈可變區（VL)。抗體片段包括熟知的Fab、F(ab'）2、Fd和Fv片段以及由一個VH 域組成的域抗體（dAb)JH域和VL域可經由合成接頭連接在一起以形成各種類型的單鏈抗 體設計，其中在VH域和VL域由單獨的單鏈抗體構建體表達的情況下，VH/VL域在分子內或 分子間配對，以形成單價抗原結合位點，諸如單鏈Fv(scFv)或雙價抗體（diabody);例如在 國際專利公布W01998/44001，國際專利公布W01988/01649,國際專利公布W01994/13804， 國際專利公布W01992/01047中有所描述。
[0037] 抗體可變區由被3個"抗原結合位點"中斷的"構架"區組成。使用多個術語來定 義抗原結合位點：（丨）三個在￥!10?1?1、!《1?2、!《1?3)中且三個在￥1^(1^〇)1?1、1^〇)1?2、1^〇)1?3) 中的互補決定區（CDR)，基于序列變異性（Wu和Kabat，JExpMed132:211-50,1970; Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第 5 版。PublicHealth Service，NationalInstitutesofHealth,Bethesda，Md·，1991)。（ii)三個在VH(HI、H2、 H3)中且三個在VL(Ll、L2、L3)中的"超變區"、"HVR"或"HV"，是指抗體可變域中的在結構 上超變的區域，如Chothia和Lesk所定義（Chothia和Lesk，MolBiol196:901-17,1987)。 其他術語包括"頂GT-CDR"（Lefranc等人，DevComparatImmunol27:55-77, 2003) 和"特異性決定殘基用途"（SDRU) (Almagro,MolRecognita: 132-43, 2004)。國際 ImMunoGeneTics(IMGT)數據庫（http://www_imgt_org)提供了抗原結合位點的標準化編 號和定義。⑶R、HV與IMGT劃分之間的對應性描述于Lefranc等人，DevComparatImmunol 27:55-77, 2003〇
[0038] 如本文所用，"Chothia殘基"是抗體VL和VH殘基，其根據Al-Lazikani來編號 (Al-Lazikani等人，JMolBiol273:927-48,1997)。
[0039]"框架"或"框架序列"是可變區的除了被定義為抗原結合位點的那些序列之外的 其余序列。因為抗原結合位點可以由如上所述的不同術語定義，所以框架的精確氨基酸序 列取決于如何定義抗原結合位點。
[0040]"人抗體"或"完全人抗體"是指包含來源于人免疫球蛋白序列的可變區和恒定區 序列的抗體。本發明的人抗體可包括替換，因此其可能不是表達的人免疫球蛋白或種系基 因序列的精確拷貝。然而，"人抗體"的定義并不包括抗原結合位點來源于非人物種的抗體。
[0041] "人適應性"抗體或"人框架適應性（HFA) "抗體是指根據美國專利公布 US2009/0118127中所描述的方法適應化的抗體，并且也指將來源于非人物種的抗原結合位 點序列移植到人框架的抗體。
[0042]"人源化抗體"是指其中抗原結合位點來源于非人物種且可變區框架來源于人免 疫球蛋白序列的抗體。人源化抗體在框架區中可包括替換，因此該框架可能不是表達的人 免疫球蛋白或種系基因序列的精確拷貝。
[0043] 如本文所用，術語"單克隆抗體"是指單分子組合物的抗體分子制劑。單克隆抗體 組合物對特定表位呈現出單一的結合特異性和親和力。
[0044] 如本文所用，術語"基本上相同"意指被比較的兩個抗體可變區氨基酸序列是相同 的或具有"非顯著性差異"。非顯著性差異是指抗體或抗體可變區域序列中有1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10或11個氨基酸被替換，這些替換不會對抗體的性質造成不利影響。與本文所 公開的可變區序列基本上相同的氨基酸序列在本申請范圍內。在一些實施例中，所述序列 同一性可為約 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高。同一性百 分數可以例如通過使用VectorΝΤΙV. 9.0.0 (Invitrogen，Carslbad，CA)的AlignX模塊的 默認設置的配對比對而確定。本發明的蛋白質序列可以用作查詢序列以針對公共或專利數 據庫進行檢索，以例如鑒定相關序列。用來進行此類檢索的示例性程序是使用默認設置的 XBLAST或BLASTP程序（http_//www_ncbi_nlm/nih_gov)或GenomeQuest?(GenomeQuest， Westborough，MA)軟件包。
[0045] 如本文所用，術語"表位"意指抗原的與抗體特異性結合的部分。表位通常由部 分（moiety)(如氨基酸或多糖側鏈）的化學活性（例如，極性、非極性或疏水性）表面定群 (grouping)構成，并且可以具有特定三維結構特征以及特定電荷特征。表位可由形成構象 空間單元的連續和/或不連續氨基酸構成。對于不連續表位，來自抗原的線性序列中不同 部分的氨基酸因蛋白質分子的折疊而在三維空間上靠近。
[0046] 如本文所用的"互補位"意指抗體的與抗原特異性結合的部分。互補位可以是本 質上線性的，或者可以是不連續的，通過抗體的非鄰近氨基酸之間的空間關系形成，而非通 過線性系列的氨基酸的空間關系形成。"輕鏈互補位"和"重鏈互補位"或"輕鏈互補位氨基 酸殘基"和"重鏈互補位氨基酸殘基"分別指與抗原接觸的抗體輕鏈和重鏈殘基。
[0047] 如本文所用，"雙特異性"是指結合兩個不同抗原或抗原內的兩個不同表位的抗 體。在雙特異性抗體與IFNa和IFNco交叉反應的情況下，雙特異性抗體可結合兩個或更 多個不同抗原。
[0048] 如本文所用，"單特異性"是指結合一個抗原或一個表位的抗體。在單特異性抗體 與IFNa和IFNo交叉反應的情況下，單特異性抗體可結合兩個或更多個不同抗原。
[0049] 如本文所用，術語"與...組合"意指所述的各試劑可以在混合物中一起、作為單 一試劑同時地或作為各單一試劑以任何順序依次地施用至動物。
[0050] 如本文所用，術語"IFNα生物活性"和"IFNω生物活性"是指由于IFNα和IFNω 分別結合至其受體IFNAR而產生的任何活性。一種IFNa和IFNco生物活性是IFNa和 IFNco在HEK293細胞中在諸如ISG54的干擾素誘導啟動子作用下誘導分泌型胚胎堿性磷酸 酶（SEAP)表達的能力，該HEK293細胞能運用標準方法穩定地表達信號傳導子及轉錄激活 子2(STAT2)、干擾素調節因子9(IRF9)和SEAP。另一種IFNa和IFNco生物活性是誘導從 外周血單核細胞（PBMC)或如本文所述的全血產生趨化因子IP-IO(CXCLIO)。
[0051]表1·
[0052]
[0053]
[0054] 術語"載體"是指能夠在生物系統內復制或可以在此類系統間移動的多核苷酸。載 體多核苷酸通常含有諸如復制起點、聚腺苷酸化信號或選擇標記的元件，其功能是促進這 些多核苷酸在生物系統中的復制或保持。此類生物系統的例子可包括細胞、病毒、動物、植 物和用能夠復制載體的生物組分再造的生物系統。包含載體的多核苷酸可為DNA或RNA分 子或這些分子的雜合分子。
[0055] 術語"表達載體"是指可用于在生物系統或再造生物系統中指導由存在于表達載 體中的多核苷酸序列所編碼的多肽的翻譯的載體。
[0056] 術語"多核苷酸"是指包含由糖-磷酸主鏈或其他等同的共價化學方式所共價連 接的核苷酸鏈的分子。雙鏈DNA和單鏈DNA以及雙鏈RNA和單鏈RNA是多核苷酸的典型例 子。
[0057] 術語"多肽"或"蛋白質"是指包含至少兩個由肽鍵連接以形成多肽的氨基酸殘基 的分子。少于50個氨基酸的小多肽可以稱作"肽"。
[0058] 本文使用如表1中所示的常規單字母和三字母氨基酸代碼。
[0059] 物質的組成
[0060] 本發明提供結合至人干擾素ω(IFNco)和多種人干擾素a(IFNa)亞型（IFNa/ω抗體）并中和其活性的單克隆抗體。本發明至少