治療由opa1單倍劑量不足引起的疾病的人工轉錄因子的制作方法
【專利說明】治療由0PA1單倍劑量不足引起的疾病的人工轉錄因子 發明領域
[0001] 本發明涉及人工轉錄因子，其包含融合至激活性結構域的特異性靶向0PA1基因 啟動子的多指鋅指蛋白和核定位序列，以及涉及它們在治療由導致單倍劑量不足的0PA1 突變引起的諸如常染色體顯性視神經萎縮（AD0A)或綜合征性AD0A+(syndromicAD0A plus)的疾病中的用途。
【背景技術】
[0002] 提出人工轉錄因子（AFT)是用于調制基因表達的有用工具（SeraT.，2009,Adv DrugDelivRev61,513-526)。許多天然存在的轉錄因子，通過抑制或激活基因轉錄來影 響基因表達，具有識別某一DNA序列的復雜的特定結構域。如果技術人員意在修飾它們的 特異性和一個或多個靶基因，則這使得它們對于操作而言是無吸引力的目標。然而，某一 類轉錄因子含有幾個所謂鋅指（ZF)結構域，它們是模塊化的，并因此使得它們可以進行遺 傳工程化。鋅指是幾乎獨立靶向三個DNA堿基對的短的（30個氨基酸）DNA結合基序。含 有融合在一起的幾個此類鋅指的蛋白因此能夠識別更長的DNA序列。六聚鋅指蛋白（ZFP) 識別18個堿基對（bp)的DNA靶標，其在整個人類基因組中幾乎是獨一無二的。最初認為 是完全背景獨立的，但更深入的分析顯示對于鋅指的某些背景特異性（KlugA.，2010,Annu RevBiochem79,213-231)。突變在鋅指識別表面中的某些氨基酸改變ZF模塊的結合特 異性產生對于大部分的5' -GNN-3'，5' -CNN-3'，5' -ANN-3'和某些5' -TNN-3'密碼子的 確定的ZF結構單元（例如所謂的Barbas模塊，見DreierB.，BarbasC.F. 3rd等，2005,J BiolChem280,35588-35597)。盡管關于人工轉錄因子的早期工作集中于基于組合預 先選擇的鋅指與已知的3bp靶序列的合理設計，但實現鋅指的某一背景特異性需要產生 大的鋅指文庫，其使用復雜方法諸如細菌或酵母單雜交、噬菌體展示、區室化核糖體展示 (compartmentalizedribosomedisplay)或使用FACS分析的體內選擇來詢問。
[0003] 使用此類人工鋅指蛋白，可以以高特異性靶向在人類基因組內的DNA基因座。因 此，這些鋅指蛋白是將具有轉錄調制活性的蛋白結構域轉運至特定啟動子序列以產生目標 基因表達的調制的理想工具。用于激活基因轉錄的合適結構域是單純皰疹病毒VP16(SEQ IDN0:1)或VP64(VP16 的四聚體重復，SEQIDN0:2)結構域（BeerliR.R.等，1998，Proc NatlAcadSciUSA95,14628-14633)。認為賦予轉錄激活的其他結構域是CJ7(SEQID N0:3)、p65-TA1(SEQIDN0:4、SAD(SEQIDN0:5)、NF-1(SEQIDN0:6)、AP-2(SEQIDN0:7)、 SP1-A(SEQIDN0:8)、SP1-B(SEQIDN0:9)、0ct-1(SEQIDN0:10)、0ct-2(SEQIDN0:11)、 0ct-2_5x(SEQIDN0:12)、MTF-1(SEQIDN0:13)、BTEB-2(SEQIDN0:14)和LKLF(SEQ IDNO: 15)。此外，認為通過基因本體論GO:0001071 (http://amigo,geneontology.org/ cgi_bin/amigo/term_details?term=G0:0001071)限定的蛋白的轉錄活性結構域實現 革巴蛋白的轉錄調節。
[0004] 盡管由于特定特征的高保守性，小分子藥物并非總能選擇性靶向給定蛋白家族的 某一成員，但如基于抗體的新藥物所顯示出的，生物制劑提供了巨大的特異性。然而，實際 上所有生物制劑到目前為止均在細胞外起作用。尤其是上文提及的人工轉錄因子將適合于 以治療上有用的方式影響基因轉錄。然而，此類因子向作用位點一細胞核一的遞送并不容 易實現，因而妨礙了治療性人工轉錄因子方法的有效性，例如通過依賴于逆轉錄病毒遞送 具有該方法的所有缺點，諸如免疫原性和細胞轉化的可能性（LundC.V.等，2005,MolCell Biol25,9082-9091)〇
[0005] 所謂的蛋白轉導結構域（PTD)顯示促進蛋白經質膜易位至細胞胞質/核質中。短 肽諸如HIV來源的TAT肽（SEQIDN0:16)和其他顯示出誘導貨物蛋白質的不依賴于細胞 類型的巨胞飲攝取（WadiaJ.S.etal.，2004,NatMed10, 310-315)。當到達細胞胞質中 時，此類融合蛋白顯示出具有生物活性。有趣的是，在蛋白轉導后，即使錯誤折疊的蛋白也 可能變得有功能，這極可能是通過胞內蛋白伴侶的作用。
[0006] 基因突變為許多遺傳性疾病的核心。在一般情況下，這樣的突變關于其遺傳方式 可以分為顯性或隱性，其中顯性突變能夠導致疾病表型，即使只有一個基因拷貝-無論是 母系或父系-受到影響，而對于隱性突變引起疾病，母系和父系兩者，多個基因拷貝需要突 變。顯性突變能夠通過兩個一般機制之一，顯性負性作用或單倍劑量不足，導致疾病。在顯 性負性突變的情況下，基因產物獲得新的異常功能，其有毒和導致疾病表型。例子是多聚蛋 白復合物的亞基，其基因突變時妨礙所述蛋白復合物的正常功能。以顯性方式遺傳的疾病 也可以由單倍劑量不足引起，其中致病突變使受影響的基因失活，因此降低了有效的基因 劑量。在這些情況下，第二完整基因拷貝無法為正常功能提供足夠的基因產物。據估計大 約 12000 個人類基因單倍劑量不足（Huangetal·，2010,PLoSGenet. 6(10)，el001154)，其 中約300個基因已知與疾病相關聯。
[0007] 神經元存活關鍵取決于線粒體功能，許多神經退行性疾病的核心是線粒體失活 (KarbowskiM.，NeutznerA.，2012，ACTANeuropathol123(2)，157-71)。除了它們以ATP 形式提供能量的基本功能，線粒體關鍵性地參與鈣緩沖，各種分解以及代謝過程和程序性 細胞死亡。線粒體的這一重要功能反映在許多適當的細胞機制中以維持線粒體并防止線粒 體失活和隨后細胞死亡（NeutznerA.etal·，2012,SeminCellDevBiol23,499-508)。 這些過程的中心作用是維護動態線粒體網絡與平衡的線粒體形態。這通過在Drpl、Fisl、 Mff、MiD49和MiD51的情況下促進線粒體裂變或在Mfnl、Mfn2和0PA1的情況下促進線粒 體小管融合的所謂的線粒體形態因子實現。平衡線粒體形態是必要的，因為線粒體融合的 損失已知促進ATP產生的損失和使細胞對凋亡刺激敏感，從而將此過程關聯到與神經變性 疾病相關的神經元細胞死亡。
[0008] 線粒體融合過程中的關鍵因素是視神經萎縮1或0PA1。0PA1是由0PA1基因編碼 的大的GTP酶并且是線粒體融合所必需的。此外，0PA1在維持作為嵴組分的內部線粒體結 構中起重要作用。據顯示0PA1基因表達的下調由于融合的損失而導致線粒體碎片且使細 胞對凋亡刺激敏感。0PA1中的突變被認為是大約70%的Kjer的視神經病變或常染色體顯 性萎縮（AD0A)的原因。在大多數人群中，AD0A在1/10' 000和3/100' 000之間盛行，其特征 是從幼兒期開始視力的逐漸降低。視覺障礙的范圍從輕微到法定失明，是不可逆轉的并由 視網膜神經節細胞（RGC)的緩慢退化引起。在大多數情況下，AD0A是非綜合征型的，然而， 大約15%的患者遭遇眼外、神經肌肉臨床表現，如感音神經性聽力損失。直到現在，還沒有 這種疾病的可行治療。有趣的是，某些0PA1等位基因與正常張力，而不是高眼壓性青光眼 有關，再次凸顯0PA1對于維持正常的線粒體生理學的重要性。
[0009] 發明概述
[0010] 本發明涉及人工轉錄因子，其包含融合至激活性蛋白結構域的靶向0PA1啟動子 的多指鋅指蛋白和核定位序列，并且涉及包含此類人工轉錄因子的藥物組合物。
[0011] 此外，本發明涉及一種人工轉錄因子，其包含融合至激活性蛋白結構域的、靶向 0PA1啟動子的多指鋅指蛋白，核定位序列和蛋白轉導結構域，以及涉及包含這種人工轉錄 因子的藥物組合物。
[0012] 本發明還涉及這種人工轉錄因子在提高0PA1基因的表達和改進0PA1基因產物的 產生中的用途。
[0013] 此外，本發明還涉及這樣的人工轉錄因子在治療由低0PA1水平引起或修飾的疾 病中的用途，尤其是用于治療眼部疾病，如AD0A和AD0A+。同樣地，本發明涉及一種治療由 低0PA1水平影響的疾病的方法，其包括對需要其的患者施用治療有效量的本發明的人工 轉錄因子。
[0014] 附圖簡述
[0015]圖1:伸用可轉導人工轉錄閔子減輕單倍劑量不足的治療方法
[0016] ㈧相比于野生型情況（wt)，單倍劑量不足突變（m)導致在啟動子⑵的控制下 的來自基因（G)的基因產物產生（GP)的減少。
[0017] (B)通過蛋白轉導結構域（PTD)如TAT或其他的作用，將包含融合至激活性結構 域（RD)的特異性靶向單倍劑量不足基因（G)的啟動子（P)區域的六聚鋅指（ZF)蛋白以及 核定位序列（NLS)的人工轉錄因子轉運至細胞內。結合至突變（HM)的啟動子和野生型基 因（G)之后，來自野生型基因拷貝的基因產物的產生增加以替代來自突變基因拷貝的基因 產物的損失。
[0018] (C)在編碼這種人工轉錄因子的cDNA的病毒轉導之后，通過細胞表達包含融合 至激活性結構域（RD)的特異性靶向單倍劑量不足基因（G)的啟動子（P)區域的六聚鋅指 (ZF)以及核定位序列（NLS)的人工轉錄因子。結合至突變（HM)的啟動子和野生型基因（G) 之后，來自野生型基因拷貝的基因產物的產生增加以替代來自突變基因拷貝的基因產物的 損失。
[0019] 圖2 :0PA1啟動子岡域
[0020] 示出的是含有0PA1啟動子（SEQIDNO:17)的0PA1的5'非翻譯區。突出顯示的 是本發明的人工轉錄因子的結合位點（下劃線，從位置85至102和91至108,從位置834 至853,和從位置983至1000的重疊位點），和用于轉錄起始的位置846 (黑體）。
[0021] 圖3 :勞光素酶報道基閔測宙以評估0PA1特異件人工轉錄閔子的活件
[0022] 用 0PAl_aktl到 0PAl_akt5 (圖A，標記為A1 至A5)或 0PAl_akt6 到 0PAl_aktl0 (圖 B，標記為A6至A10)的表達質粒和含有在人類0PA1啟動子控制下的Gaussia熒光素酶和 在CMV啟動子控制下的分泌型堿性磷酸酶的報道基因質粒共轉染HeLa細胞。用失活的（修 飾的）0PAl_aktl(圖A)或失活的（修飾的）0PAl_akt6(圖B)轉染，其中，鋅指蛋白中的所 有鋅配位的半胱氨酸殘基被更換為絲氨酸殘基，作為對照（標記為C)。共轉染后48小時測 定熒光素酶和分泌型堿性磷酸酶活性。將熒光素酶活性相對于分泌型堿性磷酸酶活性進行 標準化并表示為對照的百分數（相對于熒光素酶活性-RLA)。示出的是三個獨立實驗的平 均值以及誤差棒表示SD。
[0023] 發明詳述
[0024] 本發明涉及一種人工轉錄因子（ATF)，其包含融合至激活性蛋白結構域的、特異性 靶向0PA1啟動子（SEQIDN0:17)的多指鋅指蛋白（ZFP)，核定位序列（NLS)以及任選的蛋 白轉導結構域（PTD)，以及涉及包含這種人工轉錄因子的藥物組合物（圖1)。
[0025] 在本發明的上下文中，將啟動子定義為基因的調節區。該定義符合本領域的一般 定義。另外，在本發明的上下文中，將單倍劑量不足啟動子定義為僅當兩個功能基因拷貝存 在于基因組中時能夠在所有情況下在所有的細胞類型中導致足夠的基因產物產生的啟動 子。因此，單倍劑量不足基因的一個基因拷貝的突變在一些或者所有的生理情況下在生物 體的一些或者所有的細胞中導致不足的基因產物產生。在本發明的上下文中，將基因定義 為含有調節序列以及導致蛋白質或RNA產生的基因產物的序列的基因組區域。這個定義也 符合本領域中的一般定義。
[0026] 人工轉錄因子的蛋白轉導域（PTD)介導的胞內遞送是以新方式利用生物制劑的 高選擇性靶向病理生理學相關的分子的新方法。例如，對于由0PA1的單倍劑量不足引起的 疾病，如AD0A或AD0A+，無法想象使用當前的方法例如小分子藥物的治療，因為基因表達不 足是這種疾病的根本原因。然而，通過用人工轉錄因子技術配合以蛋白質轉導結構域（PTD)