一種基于微生物群落產酸指數的固態釀造食醋發酵過程監測方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物發酵領域，具體涉及一種基于微生物群落產酸指數的固態釀造食 醋發酵過程監測方法。
【背景技術】
[0002] 我國食醋的生產歷史悠久，釀造工藝為多菌種混合發酵工藝，通過多種微生物的 代謝作用產生風味飽滿、酸味柔和的食醋。食醋的生產中有兩個主要的發酵階段：酒精發 酵和醋酸發酵。在酒精發酵階段，淀粉質原料如糯米、高粱等經過霉菌和酵母菌的一系列代 謝，最終生成酒精；而在醋酸發酵階段決定食醋風味和品質的關鍵步驟，該過程是由眾多微 生物共同參與發酵，將乙醇轉化為酸類等眾多風味物質，因此微生物菌群是固態釀造食醋 廣品風味品質的保證。
[0003] 目前，我國眾多食醋生產廠家的食醋發酵過程控制都以傳統的操作經驗為主，主 要按照固定的發酵方法和發酵時間進行操作，發酵過程中僅對溫度、風味感官進行檢測，而 對于固態醋酸發酵過程的結束終點的判定則依賴于總酸、不揮發酸等代謝物含量等理化指 標，因此整個固態醋酸發酵過程可控性不高。醋醅中的總酸、不揮發酸、揮發性風味物質等 均為釀醋微生物菌群代謝活動的結果，因此通過總酸等代謝物指標來跟蹤食醋固態發酵過 程往往具有滯后性，一旦發現總酸、不揮發酸含量偏低則難以在發酵過程中進行工藝的及 時調整，從而導致產品品質存在批次差異，尤其是產品風味差異較大的現象時有發生。中僅 監測總酸、不揮發酸含量，未能夠根據發酵過程中微生物的變化情況進行工藝參數的及時 調整，另外，而總酸、不揮發酸、風味物質等均為微生物的代謝產物，與微生物的變化過程相 比其存在滯后性。
[0004] 隨著微生物群落高通量測序技術的迅速發展，人們可以快速地從基因水平上來研 究特定環境中微生物的種類、數量和功能，這在很大程度上有助于人們了解復雜微生物環 境的信息。國內外很多研究人員把高通量測序技術運用到對糞便、土壤、海底污泥、污水等 體系中原核生物和真核生物的微生態研究中，同時在傳統發酵食品領域也有非常廣泛的應 用，其中包括墨西哥發酵玉米團、日本黑醋、朝鮮泡菜、奶酪意大利香腸等的微生物組成和 分布的研究，取得了令人矚目的成果，為我們更好地了解國內外傳統發酵的機理提供了理 論基礎，同時也為傳統發酵行業的改革和進步提供了寶貴的理論數據支撐。
[0005] 本發明提供了一種基于微生物群落產酸指數的固態釀造食醋發酵過程的監測方 法。該方法采用高通量測序技術對固態發酵過程中間的醋醅微生物群落結構進行測定，然 后利用與總酸形成相關的微生物相對豐度數值來計算微生物群落產酸指數，并代入醋醅總 酸預測方程計算該醋醅樣品的總酸含量預測值，通過與醋醅總酸標準變化曲線比較后便能 夠知道該批次發酵過程是偏快還是偏慢，并根據結果可以及時調整發酵工藝參數，并及時 判定和預測發酵結束時間。。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于解決上述現有食醋固態釀造工藝可控性以及批次質量不穩定 的不足，提供了一種從微生物產酸機制出發通過微生物群落產酸指數的方法來監控食醋固 態發酵的正常進行，該方法準確度較高，為我國固態食醋釀造行業由"經驗型"控制向"科技 型"轉變奠定了理論基礎。
[0007] 本發明通過以下方案實現：首先對固態發酵食醋發酵過程中的醋醅樣本進行采 樣，并對醋醅樣本中的微生物群落總DNA進行提取，通過高通量測序技術對樣本基因組的 遺傳發育標記16SrDNA的V1-V3區進行高通量測序，將醋醅微生物群落中與醋醅總酸形 成有密切相關性的微生物相對豐度數值代入微生物群落產酸指數計算方程，并將計算所得 的產酸指數代入醋醅總酸含量預測方程，從而獲得醋醅總酸含量的預測值。醋醅總酸預測 值與醋醅總酸變化標準曲線進行比較，從而可以判斷和預測該批次固態發酵食醋的實際進 度，并指導食醋發酵參數的調整。該方法通過監測醋醅中與產酸相關的微生物豐度來對食 醋釀造過程進行監控，對產酸的預測準確度較高，對控制食醋品質有很好的監控作用，具體 實施路線如下：
[0008] (1)醋醅微生物群落總DNA的提取：從釀醋廠取樣醋醅樣品100g，在無菌塑封袋中 充分混勻后取5g醋醅，通過液氮研磨、溶菌酶處理、氯仿-異戊醇抽提、乙醇洗滌、RNaseA消 化等步驟提取醋醅中微生物群落的總DNA。
[0009] (2)醋醅微生物群落的高通量測序分析：對微生物群落總DNA中16SrRNA基因 V1-V3區序列進行擴增，擴增產物純化后進行定量。所有擴增產物等比例混合后在測序儀上 進行高通量測序，測序產物平均長度為500bp。測序分析完成后獲得各類微生物在整個微生 物群落中的相對豐度。
[0010] (3)微生物群落產酸指數的計算：將醋醅微生物群落中與醋醅總酸形成有正相關 關系的微生物（Acetobacter、Acinetobacter)以及與醋醅總酸形成具有負相關的微生物 (Lactobacillus、Xanthomonas、Sphingomonas、Rhizobium、Pantoea、Methylobacterium、 Staphylococcus)的相對豐度代入微生物產酸指數計算方程，獲得微生物群落產酸指數。
[0011] (4)醋醅總酸含量的預測：將上述步驟（3)中計算獲得的微生物群落產酸指數代 入醋醅總酸含量預測方程，從而可以根據微生物的相對豐度來預測醋醅總酸含量。
[0012] (5)固態釀造食醋發酵過程的判定：將上述步驟⑷獲得的醋醅總酸預測值與醋 醅總酸變化標準曲線進行比較，從而可以判斷和預測該批次固態發酵食醋的實際進度，并 指導食醋發酵參數的調整。
[0013] 本發明提供了一種基于微生物群落產酸指數的方法來監測食醋固態發酵的發酵 進程。通過測定微生物群落的相對豐度并計算產酸指數從而判斷發酵進程是偏慢、正常還 是偏快，能夠預測發酵的趨勢，有助于及時調整工藝參數，并且提前判定發酵結束時間。
【附圖說明】：
[0014] 圖1固態釀造食醋醋醅微生物群落DNA焦磷酸測序的序列長度分布
[0015] 圖2醋醅總酸含量標準變化曲線
【具體實施方式】
[0016] 鎮江香醋醋酸發酵階段是典型的固態發酵過程，下面以鎮江香醋醋酸發酵過程為 例對本發明做進一步的說明。
[0017] 實施例1:醋醅微生物群落總DNA的提取
[0018] 1、樣品采集：采集食醋發酵過程中不同時間點的醋醅樣品，樣品采集后如不能及 時提取DNA應立即進行冷凍處理。
[0019] 2、醋醅中微生物總DNA提取方法：稱取5g醋醅，在研缽中加入液氮充分研磨，轉 移至50mL離心管。向離心管中加入13. 5mLDNA抽提緩沖液和100μL溶菌酶（50mg/mL)， 于225rpm搖床上37°C搖動30min。向離心管中加入1.5mL10%SDS，65°C水浴2h，每隔 15-20min輕輕顛倒幾下，室溫6000Xg離心lOmin。收集上清；用等體積的氯仿-異戊醇 (24:1，V/V)抽提一次，以0. 6倍體積的異丙醇室溫沉淀1h，16000Xg離心20min，收集沉 淀，用預冷的70 %乙醇洗滌沉淀，DNA沉淀干燥后溶于100μLTE中，加入終濃度為0. 5μg/ mLRNaseA，并在37°C下水浴消化2h，以去除RNA，用1. 5%瓊脂糖凝膠電泳驗證DNA提取的 效果，如果在l〇kb左右出現條帶，則DNA提取成功。
[0020] 實施例2 :16SrRNA高通量測序分析醋醅微生物群落結構
[0021] 1.barcode-PCR擴增
[0022] 細菌16S rDNAVfV^PCR擴增所用的引物可以擴增16S rDNA乂^乂返約500bp 的片段，對應E. coli 16S rDNA 5到534的位點。為方便測序后序列的提取，每個樣本對應 一個含有7個堿基的barcode序列，即在引物一端加上barcode片段，序列如下：
[0023] Forward: 5 ' -XXXXXXX-TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '
[0024] Reverse:5，-XXXXXXX-TACCGCGGCTGCTGGCAC-3，
[0025] barcode-PCR采用25μL體系，具體如下：
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[0027] barcode-PCR的反應條件具體如下：
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