光復粳水稻抗黑條矮縮病位點及分子標記方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及光復粳水稻抗黑條矮縮病位點及分子標記方法，屬于農業科學技術領域。
【背景技術】
[0002]水稻黑條矮縮病是一種由水稻黑條矮縮病毒(Rice black-streaked dwarfvirus, RBSDV)引起的病毒病，主要以灰飛虱為傳播介體進行傳播。宿主有雜交水稻、常規水稻、大麥、小麥、玉米、小米、高粱、看麥娘、早熟禾、罔草、稗草、馬塘等28種。水稻黑條矮縮病毒侵染玉米致其得玉米粗縮病，侵染小麥致其得小麥從矮病，這些病的病原形態、寄主及癥狀、介體昆蟲及傳病特性等都極其相似。水稻黑條矮縮病在水稻苗期、分蘗期、拔節期均可發病，因感染時期不同，病癥略有差異，苗期與分蘗期最易感病，且發生較重。水稻黑條矮縮病的典型癥狀是病株矮縮，葉色濃綠僵硬，葉背、葉鞘和莖桿有早期蠟白色，后期為黑褐色的短條癥狀不規則突起，通常發病植株不抽穗或者極少結實，被喻為水稻“癌癥”。
[0003]水稻黑條矮縮病首先在日本發現。60年代，水稻黑條矮縮病在日本大部分地區流行。我國黑條矮縮病最早于1963年在浙江省余姚縣的早稻上發現，同時在上海市嘉定和奉賢縣、江蘇省蘇州和鎮江等地區的水稻上、揚州和南通等地區的玉米上有局部危害，主要影響華東地區。20世紀60年代水稻黑條矮縮病在我國華東諸省市大爆發后20年，由于麥田翻耕和早稻移栽等耕作方式的興起，殺滅了第一代灰飛虱若蟲，病害的初侵染受阻，致使發病面積逐年下降。80年代后，由于擴種小麥，又給本病初侵染創造了有利的寄主條件，致使本病在90年代再次大爆發，在浙江、上海、江蘇、安徽、江西和福建省北部等長江中下游地區廣泛發生，造成嚴重的經濟損失。近年來，隨著耕作制度和栽培方式的變化、農田生態多樣、冬季氣候變暖和感病品種的大面積推廣，水稻黑條矮縮病在江蘇、浙江、湖南等省大規模發生，主要危害雜交中稻、一季晚稻，通常損失稻谷二成以上，嚴重的甚至絕收。水稻黑條矮縮病在長江中下游地區、黃淮海地區的爆發，嚴重挫傷了稻農的種糧積極性，危害了我國糧食產業的安全。
[0004]目前，對水稻黑條矮縮病的防治主要是使用農藥防治傳毒介體灰飛虱，但由于介體昆蟲種群數量大，導致防治效果不佳，且存在環境污染。而培育抗病品種是防治各類病害最為經濟、有效的手段。篩選、發掘和創新抗病種質是開展抗病育種的前提和基礎，而抗性基因定位和克隆，則為利用標記輔助選擇等分子育種手段，加快和高效培育抗病品種提供了全新和有利工具。但迄今，對水稻黑條矮縮病抗性種質的篩選、抗性遺傳基本特性還鮮有研究。進行水稻黑條矮縮病抗性QTL檢測和遺傳效應分析，可以為水稻黑條矮縮病的抗性遺傳育種應用研究提供基礎。
[0005]有關水稻黑條矮縮病的病原形態、寄主癥狀、介體昆蟲及傳播特性、發生特點、流行規律等已基本得到闡明，對水稻黑條矮縮病毒的核酸序列的測定和相關基因克隆也有報道。水稻黑條矮縮病遺傳、育種研究目前基本處于起步狀態，未能引起高度重視，可能是由于水稻黑條矮縮病20世紀60年代中期發生后近30年基本銷聲匿跡的原因。鑒于近年來水稻黑條矮縮病危害逐年加重，部分地區泛濫成災，加強相關應用基礎研究勢在必行。目前水稻黑條矮縮病抗性基因的定位鮮有報道，可能是由于過去未能引起高度重視的原因，抗性基因定位目前基本都處于起步狀態。
[0006]篩選、發掘和創新抗病種質是開展抗病育種的前提和基礎，而抗性基因定位和克隆，則為利用分子標記輔助選擇，加快育種進程奠定基礎。迄今為止，在生產上也沒有發現對RBSDV免疫的品種，所以對水稻黑條矮縮病抗性種質進行大規模篩選和展開水稻黑條矮縮病抗性定位研究顯得尤為迫切。
[0007]目前常規水稻抗黑條矮縮病資源篩選抗病品種、抗病基因定位鑒定抗性家系均采用田間自然發病鑒定，即將各鑒定品種或品系小區形式種植于大田，每個小區幾十株左右，大田常規栽培管理，傳毒介體灰飛虱自然傳毒，待水稻顯現病癥后調查各鑒定品種(家系)小區的穴發病率，以此為標準鑒別水稻品種(家系)的抗感能力的差異。然而，由于植物對天敵的抗性分為耐害性、抗生性和排趨性三種類別，各種抗性類別具由不同的抗性機理，水稻也不其外。不同水稻品種(家系)對灰飛虱排趨性的差異使得不同水稻品種(家系)的某些形態和生理等特性，表現出對灰飛虱的取食偏向的差異。而水稻黑條矮縮病的傳毒介體正為灰飛虱，因此，通過自然鑒定方法鑒定得到的抗病水稻，可能實際上是抗蟲(排趨性強)水稻而并非抗病水稻。然而，假若以該抗蟲不抗病水稻育成品種進行病害區規模種植后，規模種植導致傳毒介體被迫選擇而使得水稻對灰飛虱排趨產生的假抗病表現消失，可能給農業生產帶來較大的損失。
[0008]田間自然發病的不能排除灰飛虱排趨性的干擾，常規方法進行的抗病基因不夠準確，因此，本研究小組改良了灰飛虱排趨性鑒定方法，采用田間自然鑒定與改良灰飛虱排趨性鑒定組合的方法，篩選到了抗水稻黑條矮縮病品種資源，并進一步準確定位了水稻黑條矮縮病抗病基因而排除了灰飛虱排趨的干擾，我們的研究對水稻黑條矮縮病抗病育種提供了重要的指導信息。
【發明內容】
[0009]本發明的目的是針對常規育種中水稻黑條矮縮病抗性鑒定穩定性、重復性較差及費時費力等缺點，提供了光復粳水稻抗黑條矮縮病位點及分子標記方法，該方法可以預測植株對水稻黑條矮縮病的抗性，簡化了選擇方法，進而加快抗病品種的育種進程。
[0010]本發明的目的可通過如下技術方案實現:
光復粳水稻抗黑條矮縮病位點及分子標記方法，其特征在于:用分子標記RM6082引物:SEQ ID N0.1/SEQ ID N0.2，或者用自行合成的分子標記05-22引物:SEQ ID N0.3/SEQID N0.4擴增水稻抗黑條矮縮病鑒定材料，如果用分子標記RM6082引物:SEQ ID N0.1/SEQ ID N0.2能夠擴增出147bp的擴增片段，或用自行合成的分子標記05-22引物:SEQ IDN0.3/SEQ ID N0.4能夠擴增出265bp的擴增片段，則標志著水稻材料內存在抗黑條矮縮病位點 qRBSDV19o
[0011 ] 該方法包含以下步驟:
(1)以水稻黑條矮縮病抗源光復粳為母本，水稻黑條矮縮病高感品種揚農粳2號為父本，配制雜種F1，構建了包含282個單株的F2分離群體，F2單株自交獲得F2:3家系；
(2)對F2:3家系采用田間自然鑒定與改良灰飛虱排趨性鑒定組合的方法，進行水稻黑條矮縮病抗病性鑒定；
(3)親本、F1及F2:3定位群體單株的DNA采用TPS粗提法提取；
(4)用實驗室已有的大體平均分布于水稻12條染色體的308對SSR引物(含59對自行合成引物)，對親本、F1及F2:3定位群體進行PCR擴增尋找兩兩之間同時具有穩定多態性的引物，用篩選到的多態性分子標記檢測F2:3家系；
(5)根據定位群體各單株分子標記多態性檢測結果，并結合其抗性表型參數，用Mapmaker/Exp3.0軟件進行基因和分子標記位點的遺傳連鎖分析，利用Kosambi作圖函數將交換率轉換為遺傳距離(CM);
(6)采用基于復合區間作圖法軟件WindowsQTL Cartographer V2.5檢測水稻黑條矮縮病的抗性QTL，L0D值的閾值定為2.0，按P = 0.005概率值檢測抗性QTL的數目及其在染色體上的位置；
(7)獲得水稻黑條矮縮病抗性品種光復粳抗黑條矮縮病基因位點qRBSDV19，位于第5號染色體分子標記RM6082與自行合成的分子標記05-22之間，通過檢測第5號染色體上該兩個引物標記的帶型數據，可以預測該植株對水稻黑條矮縮病的抗性，大大提高抗黑條矮縮病水稻的選擇效率。
[0012]所述的采用田間自然鑒定與改良灰飛虱排趨性鑒定組合的方法進行水稻黑條矮縮病抗病性鑒定的具體方案為:
(1)待鑒定材料大田小區種植，采用水育手工移栽法，每品種單本移栽60-120株，秧田期和大田移栽早期均不防治灰飛虱，其他時間按當地生產常規管理，水稻移栽活棵后調查基本苗，水稻分蘗高峰期調查每份材料水稻黑條矮縮病發病率A ；
(2)將催芽后的水稻種子播于65cmX44cmX14cm的塑料周轉箱內，每份材料1行，每行10株，待幼苗長至1.5-2.0葉，按每株10頭接入3-4齡的灰飛虱若蟲，每天上午8時、下午4時調查每個單株上的蟲數，每次調查后進行驅蟲，使其盡量均勻分布，環境溫度保持在26±2°C，自然光照，5天后計算每份材料每個單株上的平均蟲數，作為排驅性測驗值，進一步按照每份材料單株平均蟲數/整個家系單株平均蟲數計算相對排趨性指數B ;
(3)根據經驗計算公示計算每份材料水稻黑條矮縮病抗病指數C:C=1-A/ V B，以抗病指數C作為定位群體的抗性表型參數。
[0013]所述的擴增黑條矮縮病位點qRBSDV19的分子標記引物選自分子標記RM6082引物:SEQ ID N0.1/SEQ ID N0.2 和自行合成的分子標記 05-22 引物:SEQ ID N0.3/SEQ IDN0.4。
[0014]所述的對親本、FI及F2:3定位群體進行PCR擴增的PCR反應體系為:總體積為20μ?，反應液組成為 10XPCR buffer(200mmol/L Tris-HCl pH8.4,500mmol/L KCl，15mmol/L MgCl2，stabilizers)2PL，10mmol/L dNTPs 1.2μ?，引物各50ng，基因組DNA50ng，1.0U TaqDNA聚合酶，補水至20μ? ;PCR擴增程序為:94°C預變性5min ;94°C變性lmin，50°C退火復性lmin，72°C延伸50_90s，共35個循環；最后72°C保溫lOmin ;擴增產物經聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)銀染檢測。
[0015]本發明所提供的光復粳水稻抗黑條矮縮病位點及分子標記方法，具有以下優點:
(1)本發明采用田間自然鑒定與改良灰飛虱排趨性鑒定組合的方法進行水稻黑條矮縮病抗病性鑒定，其鑒定結果排除了灰飛虱排趨性的干擾，表型鑒定方法更加準確可信； (2)本發明分子標記定位的抗性基因位點位置明確，鑒定方便。本發明通過檢測5號染色體上與水稻黑條矮縮病抗性QTL緊密連鎖的SSR標記，即可以預測水稻植株的黑條矮縮病抗性水平，大大提高了抗黑條矮縮病水稻的選擇效率，加快了育種進程。
【附圖說明】
[0016]圖1所示5號染色體上與水稻黑條矮縮病抗性QTL緊密連鎖的SSR標記在染色體上的位置。
[0017]圖2所示應用5號染色體上與水稻黑條矮縮病抗性QTL緊密連鎖的SSR標記預測植株水稻黑條矮縮病抗性的電泳圖譜。M:Mark ；1:光復粳；2:揚農粳2號；3:F1 ；4~12:抗病單株；13_20