檢測sca致病基因突變的方法，及其引物、試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬分子生物學技術領域，涉及檢測SCA致病基因突變的方法，及其引物、試 劑盒。
【背景技術】
[0002] SCA(Spino_cerebellarataxias)是一種脊髓小腦共濟失調疾病，現有的檢測SCA 的致病基因技術主要是基于單個突變位點的PCR和測序方法及單基因芯片方法，顯著缺點 主要在于僅僅能檢測單個突變位點，不能對多個突變位點進行同時檢測，也不能對分布于 多個外顯子的位點進行同時檢測。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的在于克服上述不足，提供一種檢測SCA致病基因突變的方法，其解 決了現有技術中進行SCA致病基因突變檢測程序繁瑣、費用昂貴、費時、易污染和靈敏度低 等問題。
[0004] 為了實現上述目的，本發明采用的技術方案為：一種檢測SCA致病基因突變的方 法，不用于疾病的診斷和治療，其特征在于，其包括如下實現步驟：
[0005] 樣本處理：取外周血2ml于EDTA抗凝管中，輕柔地顛倒混勻，4°C保存；
[0006] DNA提取，取220μL抗凝血用試劑盒提取DNA，包括：
[0007] 1)加 220yLBufferBL，震蕩混合，于 70°C孵育lOmin;
[0008] 2)加220μL無水乙醇震蕩混合約20sec;
[0009] 3) 12000rpm離心lmin;
[0010] 4)取上清轉入收集柱中，12000rpm離心2min;
[0011] 5)將收集柱置一個新的收集管上，加入500μLHBsolution，室溫放置5min;
[0012] 6) 12000rpm離心 2min;
[0013] 7)加入 700μLwashBuffer，12000rpm離心 2min;
[0014] 8)將收集柱置一個新的收集管上，加入700μLwashBuffer，12000rpm離心 2min；
[0015] 9)棄收集管內液體，12000rpm離心2min;
[0016] 10)將收集柱放入一個新的1. 5ml離心管內，加入50μL70°C預熱的洗脫液，室 溫放置l-2min，12000rpm離心2min，濾液即為模板DNA;
[0017] PCR擴增
[0018] PCR反應體系：
[0019] 10XPCRBuffer2yL；
[0020] HotStarTaqDNAPolymerase按kit標準調整；
[0021] dNTPmix2μL；
[0022] 上游引物PrimerU1μL;
[0023] 下游引物PrimerL1μL;
[0024] DNA模板χμL;
[0025] 滅菌蒸餾水20μL上述總體積；
[0026] PCR產物電泳：1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果；
[0027] PCR產物純化
[0028] 每管內加入100μLPCR-A液，混勻，轉入純化柱內，12000rpm離心2min;
[0029] 棄收集管內液體，加入700 μLwashing buffer，12000rpm離心2min;
[0030] 棄收集管內液體，加入400 μLwashing buffer，12000rpm離心2min;
[0031] 棄收集管內液體，12000rpm離心2min;
[0032] 柱內加入30μL70°C預熱洗脫液，12000rpm離心3min;
[0033] 測序反應
[0034] 反應體系：0· 8 yL Big Dye+1. 5 yL Big Dye Seq Buffer+3 yL引物+1 yL PCR純 化產物+3. 5μL ddH20;
[0035] 測序PCR熱循環條件：
[0036] 1)變性的條件，96°ClOsec;
[0037] 5)退火的條件，（首先96°ClOsec，其次50°C5sec，然后60°C4min)X25個循環；
[0038] 6)延伸的條件，60°C4min;
[0039] 7)4°C保溫；
[0040] 每一步的時間應從反應混合液達到所要求的溫度后開始計算；
[0041] 測序產物純化
[0042] 10μL反應體系，96孔板，酒精/EDTA/NaAc法；
[0043] l)每管加入l(K)μLl(K)%酒精，或每管加入lμL125mMEDTA到管底，或每管加 入1yL3MNaAc到管底，然后震蕩混勻，室溫放置15min;
[0044] 2) 10°C，4000rpm離心 30min，馬上倒置，1200rpm離心lmin;
[0045] 3)每管加入100μL70 %酒精，離心15min;5°C，3600rpm離心30min，馬上倒置， 1200rpm離心lmin;
[0046] 4)室溫揮發凈酒精，加入10μLHi-Di Formamide溶解DNA;
[0047] 5) 95°C變性 5min，4°C保溫 4min，加樣上機；
[0048] 6)測序純化：使用ABIBigdyeXTerminatorpurificationkit;
[0049] PCR檢測，包括：
[0050] 1)對照孔的設立和檢測重復孔：樣本檢測同時設有對照實驗，包括陰性對照；對 照和樣本均采用復孔；
[0051] 在SCA基因突變位點兩端設計三對特異性引物；
[0052] 所述引物是SCA 1、SCA 2和SCA 3;
[0053] 所述引物SCA1的sense為：
[0054] 5' ACCTTCCAGTTCATTGGGTC 3'，
[0055] 所述引物SCA1 的antisense為：
[0056] 5' GTGTGTGGGATCATCGTCTG 3'，
[0057] 所述引物SCA2的sense為：
[0058] 5' CTCCCTCCGCCTCAGACTGTT 3'，
[0059]所述引物SCA 2的antisense為：
[0060] 5, CTGGACAGGCCTGACAATCCC 3'，
[0061] 所述引物SCA 3的sense為：
[0062] 5' TTCCTAAGATCAGCACTTCC 3'，
[0063]所述引物SCA 3的antisense為：
[0064] 5'GATAAAGTGTGAAGGTAGCG 3'；
[0065] 所述引物PCR擴增出目的片段模板；
[0066] 所述目的片段的獲取包括：以上述引物分別對人基因組DNA進行PCR擴增得到條 帶單一的目的基因片段；將目的片段稀釋至1萬-10萬倍，終濃度為10-20ng/ μ L，作為檢 測陰性對照用；
[0067] 2) 25 μ L反應體系檢測：
[0068]
[0069] 混合均勻；所有樣本混合完后，將ABI Veriti Dx PCR系統儀器中進行程序性檢 測；
[0070] 結果分析及判定：對PCR產物進行測序分析。
[0071] 本發明的另一目的在于提供一種檢測SCA致病基因突變的引物，其特征在于，所 述引物序列包括：
[0072] SEQ ID N0:15'ACCTTCCAGTTCATTGGGTC 3'
[0073] SEQ ID NO:25'GTGTGTGGGATCATCGTCTG 3'
[0074] SEQ ID NO:35'CTCCCTCCGCCTCAGACTGTT 3'
[0075] SEQ ID NO:45,CTGGACAGGCCTGACAATCCC 3'
[0076] SEQ ID NO:55'TTCCTAAGATCAGCACTTCC 3'
[0077] SEQ ID N0:65，GATAAAGTGTGAAGGTAGCG 3,。
[0078] 本發明的還一目的在于提供一種包含所述引物的檢測SCA致病基因突變的試劑 盒。
[0079]本發明的有益效果為：
[0080] 能對多個突變位點進行同時檢測，也能對分布于多個外顯子的位點進行同時檢 測，簡單、快速、準確、有效的對脊髓小腦共濟失調疾病進行檢測和臨床診斷，利用多種特異 性引物同時對患者可能存在的多個突變位點進行檢測，使用該方法能保證95%以上的疾病 檢出率。其解決了現有技術中進行SCA致病基因突變檢測程序繁瑣、費用昂貴、費時、易污 染和靈敏度低等問題，尤其是提供了病理組織之外的非創傷性如血清或血漿等檢測。
【附圖說明】
[0081] 此處所說明的附圖用來提供對本申請的進一步理解，構成本申請的一部分，本申 請的示意性實施例及其說明用于解釋本申請，并不構成對本申請的不當限定。在附圖中：
[0082] 圖1是本發明實施例1中SCA1~3電泳結果示意圖。
[0083] 圖2是本發明應用實施例1中正常人SCA1突變位點基因序列測序的示意圖。
[0084] 圖3是本發明應用實施例1中正常人SCA2突變位點基因序列測序的示意圖。
[0085] 圖4是本發明應用實施例1中正常人SCA3突變位點基因序列測序的示意圖。
【具體實施方式】
[0086] 以下結合具體實施例對上述方案做進一步說明。應理解，這些實施例是用于說明 本發明而不限于限制本發明的范圍。實施例中采用的實施條件可以根據具體廠家的條件做 進一步調整，未注明的實施條件通常為常規實驗中的條件。
[0087] 實施例1
[0088] 樣本處理：體檢無相關SCA疾病病史的人外周血2ml(樣品由首都醫科大學宣武醫 院提供）于m)TA抗凝管中，輕柔地顛倒混勻，4°C保存；
[0089] DNA提取，取220μL抗凝血用試劑盒提取DNA，包括：
[0090] 1)加 220yLBufferBL，震蕩混合，于 70°C孵育lOmin;
[0091] 2)加220μL無水乙醇震蕩混合約20sec;
[0092] 3) 12000rpm離心lmin;
[0093] 4)取上清轉入收集柱中，12000rpm離心2min;
[0094] 5)將收集柱置一個新的收集管上，加入500μLHBsolution，室溫放置5min;
[0095] 6) 12000rpm離心 2min;
[0096] 7)加入 700μLwashBuffer，12000rpm離心 2min;
[0097] 8)將收集柱置一個新的收集管上，加入700μLwashBuffer，12000rpm離心 2min；
[0098] 9)棄收集管內液體，12000rpm離心2min;