Tspan15在制備骨性關(guān)節(jié)炎診斷制劑中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及TSPAN15在制備骨性關(guān)節(jié)炎診斷制劑中的應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，0A)是一種隨著年齡的增長而發(fā)生率明顯增加的 退行性關(guān)節(jié)炎疾病，也是老年人關(guān)節(jié)疼痛和致殘的主要原因。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)，膝 骨性關(guān)節(jié)炎在女性患病率中占第四位，隨著年齡的增長，其患病率也明顯上升，大于65歲 的人群中50%以上都有骨性關(guān)節(jié)炎的臨床表現(xiàn)。目前對于骨性關(guān)節(jié)炎的治療方法主要是 早期采用非手術(shù)治療，止痛、保護(hù)和延緩軟骨的退化；晚期軟骨破壞嚴(yán)重，有剝脫或者游離 體，骨贅增生等，此階段就要采用手術(shù)治療，例如關(guān)節(jié)清理、截骨術(shù)或融合術(shù)、人工關(guān)節(jié)置換 術(shù)等，而漫長的保守治療和昂貴的手術(shù)費(fèi)用對于骨性關(guān)節(jié)炎這種慢性疾病尤不適合。因此， 明確0A的發(fā)病機(jī)制，找尋預(yù)防0A、早期干預(yù)并延緩軟骨退變進(jìn)程的方法就成為醫(yī)學(xué)上亟待 解決的問題。
[0003] 發(fā)明人對7例骨性關(guān)節(jié)炎滑膜組織及4例對照樣本進(jìn)行高通量測序，結(jié)合生物信 息學(xué)方法進(jìn)行基因篩選，在差異表達(dá)明顯的基因中挑選出高表達(dá)的候選基因TSPAN15，現(xiàn)有 研究中并沒有TSPAN15和骨性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的報(bào)道，進(jìn)一步，發(fā)明人進(jìn)行了分子細(xì)胞生物學(xué) 方法驗(yàn)證，證實(shí)了TSPAN15在骨性關(guān)節(jié)炎組織中高表達(dá)，TSPAN15抑制劑可用于制備治療骨 性關(guān)節(jié)炎藥物。本發(fā)明提供了一種新的骨性關(guān)節(jié)炎的治療靶點(diǎn)，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種骨性關(guān)節(jié)炎診斷制劑，所述骨性關(guān)節(jié)炎診斷制劑檢測 TSPAN15基因和/或TSPAN15基因的表達(dá)產(chǎn)物。
[0005] 進(jìn)一步，所述骨性關(guān)節(jié)炎診斷制劑采用熒光定量PCR試劑盒、基因芯片、免疫方法 檢測骨性關(guān)節(jié)炎組織中TSPAN15基因的表達(dá)，優(yōu)選的，所述的熒光定量PCR試劑盒中含有一 對特異性擴(kuò)增TSPAN15基因的引物；所述的基因芯片中包括與TSPAN15基因的核酸序列雜 交的探針，更優(yōu)選的，熒光定量PCR試劑盒內(nèi)含有特異性檢測TSPAN15基因的上游引物和下 游引物，上游引物序列為SEQIDN0. 9,下游引物序列為SEQIDN0. 10。
[0006] 進(jìn)一步，所述的骨性關(guān)節(jié)炎的診斷制劑采用免疫方法檢測骨性關(guān)節(jié)炎滑膜組織中 TSPAN15基因的表達(dá)產(chǎn)物，優(yōu)選的，所述免疫方法為ELISA檢測和/或膠體金檢測。
[0007] 進(jìn)一步，所述檢測TSPAN15表達(dá)產(chǎn)物的ELISA法為使用ELISA檢測試劑盒。所 述試劑盒中的抗體可采用市售的TSPAN15單克隆抗體。進(jìn)一步，所述的試劑盒包括：包被 TSPAN15單克隆抗體的固相載體，酶標(biāo)抗體，酶的底物，蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，陰性對照品，稀釋液，洗 滌液，酶反應(yīng)終止液等。
[0008] 進(jìn)一步，所述檢測TSPAN15蛋白的膠體金法為使用檢測試劑盒，所述的抗體可采 用市售的TSPAN15單克隆抗體。進(jìn)一步，所述的膠體金檢測試劑盒采用膠體金免疫層析技 術(shù)或膠體金滲濾法。進(jìn)一步，所述的膠體金檢測試劑盒硝酸纖維素膜上的檢測區(qū)（T)噴點(diǎn) 有抗TSPAN15單克隆抗體、質(zhì)控區(qū)（C)噴點(diǎn)有免疫球蛋白IgG。
[0009] 本發(fā)明的目的在于提供上述骨性關(guān)節(jié)炎診斷制劑在制備骨性關(guān)節(jié)炎診斷工具中 的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明的目的在于提供一種治療骨性關(guān)節(jié)炎的制劑，所述制劑中含有抑制 TSPAN15基因的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)的試劑或化合物。
[0011] 進(jìn)一步，所述治療骨性關(guān)節(jié)炎的制劑中含有激活TSPAN15的抑制基因、激活抑制 TSPAN15表達(dá)的蛋白、導(dǎo)入抑制TSPAN15轉(zhuǎn)錄或表達(dá)的siRNA、激活促進(jìn)TSPAN15mRNA降解 的microRNA、導(dǎo)入促進(jìn)TSPAN15蛋白降解的分子、抑制促進(jìn)TSPAN15表達(dá)的因子及蛋白的表 達(dá)。
[0012] 優(yōu)選的，所述治療骨性關(guān)節(jié)炎的制劑含有下列中的一組或幾組siRNA:SEQID NO. 1 和SEQIDNO. 2、SEQIDNO. 3 和SEQIDNO. 4、SEQIDNO. 5 和SEQIDNO. 6。更優(yōu)選 的，所述治療骨性關(guān)節(jié)炎的制劑含有siRNA序列為SEQIDNO. 5和SEQIDNO. 6。
[0013] 本發(fā)明的目的在于提供上述治療骨性關(guān)節(jié)炎的制劑在制備骨性關(guān)節(jié)炎治療藥物 或試劑中的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明的目的在于提供一種促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖制劑，所述促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖制劑 中含有抑制TSPAN15基因和/或TSPAN15基因的表達(dá)產(chǎn)物的化合物。
[0015] 進(jìn)一步，所述促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖制劑中含有激活TSPAN15的抑制基因、激活抑制 TSPAN15表達(dá)的蛋白、導(dǎo)入抑制TSPAN15轉(zhuǎn)錄或表達(dá)的siRNA、激活促進(jìn)TSPAN15mRNA降解 的microRNA、導(dǎo)入促進(jìn)TSPAN15蛋白降解的分子、抑制促進(jìn)TSPAN15表達(dá)的因子及蛋白的表 達(dá)。
[0016] 優(yōu)選的，所述促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖制劑含有下列中的一組或幾組siRNA:SEQID Ν0· 1 和SEQIDΝ0· 2、SEQIDΝ0· 3 和SEQIDΝ0· 4、SEQIDΝ0· 5 和SEQIDΝ0· 6。更優(yōu)選 的，所述治療骨性關(guān)節(jié)炎的制劑含有siRNA序列為SEQIDNO. 5和SEQIDNO. 6。
[0017] 本發(fā)明的目的在于提供上述促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖制劑在制備促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖工 具中的應(yīng)用。
[0018] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先通過高通量測序結(jié)合生物信息學(xué)方法篩選到候選基 因TSPAN15基因，進(jìn)而通過分子細(xì)胞生物學(xué)方法驗(yàn)證了TSPAN15基因與骨性關(guān)節(jié)炎的關(guān)系： TSPAN15基因在滑膜組織中高表達(dá)，與骨性關(guān)節(jié)炎具有很好的相關(guān)性，可用于制備骨性關(guān)節(jié) 炎輔助診斷制劑，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。
[0019] 本領(lǐng)域人員熟知抑制基因及其表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)通?？梢圆捎孟率龇椒ㄖ械囊环N 和/或幾種：通過激活目的基因的抑制基因、激活目的基因的抑制基因表達(dá)的蛋白、采用RNA干擾技術(shù)抑制目的基因表達(dá)、激活促進(jìn)目的基因mRNA降解的microRNA、導(dǎo)入促進(jìn)目的 基因編碼蛋白降解的分子、抑制促進(jìn)目的基因表達(dá)的因子及蛋白的表達(dá)。
[0020] RNA干擾（RNAi)是指外源性和內(nèi)源性雙鏈RNA在生物體內(nèi)誘導(dǎo)同源靶基因的 mRNA特異性降解，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后基因沉默的現(xiàn)象，是一種使用小的雙鏈RNA高效、特異地阻斷 體內(nèi)某種特定基因的表達(dá)，促使mRNA降解，使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失表型的技術(shù)。siRNA 設(shè)計(jì)完成后可以采用直接合成法或者構(gòu)建siRNA表達(dá)載體，制備好的siRNA可以通過磷酸 I丐共沉淀法、電穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene法、顯微注射或基因槍等機(jī)械法、陽離子 脂質(zhì)體試劑法等途徑轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
[0021] 熒光定量PCR法是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo) 記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測樣品模板 的初始濃度。熒光定量PCR的出現(xiàn)，極大地簡化了定量檢測的過程，而且真正實(shí)現(xiàn)了絕對定 量。多種檢測系統(tǒng)的出現(xiàn)，使實(shí)驗(yàn)的選擇性更強(qiáng)。自動(dòng)化操作提高了工作效率，反應(yīng)快速、 重復(fù)性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)、結(jié)果清晰。
[0022] 基因芯片又稱為DNA微陣列（DNAmicroarray)，可分為三種主要類型：1)固定在聚 合物基片（尼龍膜，硝酸纖維膜等）表面上的核酸探針或cDNA片段，通常用同位素標(biāo)記的 靶基因與其雜交，通過放射顯影技術(shù)進(jìn)行檢測。2)用點(diǎn)樣法固定在玻璃板上的DNA探針陣 列，通過與熒光標(biāo)記的靶基因雜交進(jìn)行檢測。3)在玻璃等硬質(zhì)表面上直接合成的寡核苷酸 探針陣列，與熒光標(biāo)記的靶基因雜交進(jìn)行檢測?；蛐酒鳛橐环N先進(jìn)的、大規(guī)模、高通量 檢測技術(shù)，應(yīng)用于疾病的診斷，其優(yōu)點(diǎn)有以下幾個(gè)方面：一是高度的靈敏性和準(zhǔn)確性；二是 快速簡便；三是可同時(shí)檢測多種疾病。
[0023] 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA)即將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標(biāo) 記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行的技術(shù)。該技術(shù)可用于檢測大分子抗原和特異性抗體 等，具有快速、靈敏、簡便、載體易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)。ELISA檢測試劑盒根據(jù)檢測目的和操作 步驟可分為間接法、雙抗夾心法、競爭法、雙位點(diǎn)一步法、捕獲法測IgM抗體、應(yīng)用親和素和 生物素的ELISA。ELISA檢測試劑盒中生色底物可選擇辣根過氧化物酶（HRP)或者堿性磷 酸酶（AP)。
[0024] 常用的免疫膠體金檢測技術(shù)：（1)免疫膠體金光鏡染色法細(xì)胞懸液涂片或組織切 片，可用膠體金標(biāo)記的抗體進(jìn)行染色，也可在膠體金標(biāo)記的基礎(chǔ)上，以銀顯影液增強(qiáng)標(biāo)記， 使被還原的銀原子沉積于已標(biāo)記的金顆粒表面，可明顯增強(qiáng)膠體金標(biāo)記的敏感性。（2)免疫 膠體金電鏡染色法可用膠體金標(biāo)記的抗體或抗抗體與負(fù)染病毒樣本或組織超薄切片結(jié)合， 然后進(jìn)行負(fù)染?？捎糜诓《拘螒B(tài)的觀察和病毒檢測。（3)斑點(diǎn)免疫金滲濾法應(yīng)用微孔濾膜 作載體，先將抗原或抗體點(diǎn)于膜上，封閉后加待檢樣本，洗滌后用膠體金標(biāo)記的抗體檢測相 應(yīng)的抗原或抗體。（4)膠體金免疫層析法將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在膜上，膠 體金標(biāo)記試劑（抗體或單克隆抗體）吸附在結(jié)合墊上，當(dāng)待檢樣本加到試紙條一端的樣本 墊上后，通過毛細(xì)作用向前移動(dòng)，溶解結(jié)合墊上的膠體金標(biāo)記試劑后相互反應(yīng)，當(dāng)移動(dòng)至固 定的抗原或抗體的區(qū)域時(shí)，待檢物與金標(biāo)試劑的結(jié)合物又與之發(fā)生特異性結(jié)合而被截留， 聚集在檢測帶上，可通過肉眼觀察到顯色結(jié)果。該法現(xiàn)已發(fā)展成為診斷試紙條，使用十分方 便。
[0025] 本發(fā)明的目的在于提供一種檢測骨性關(guān)節(jié)炎的基因檢測試劑盒，所述試劑盒檢測 基因TSPAN15，采用特異的上游引物和下游引物，上游引物序列為SEQIDN0. 9，下游引物序 列為SEQIDN0. 10。
[0026] 進(jìn)一步，該P(yáng)CR試劑盒適合于目前存在市