一種遺傳性耳聾基因檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】：
[0001] 本發明屬體外診斷試劑領域，具體的，涉及一種試劑盒，更具體的，涉及一種遺傳 性耳聾基因（9個型）核酸分型檢測試劑盒。
【背景技術】：
[0002] 耳聾是導致交流障礙最常見的疾病，大多數發病都與遺傳有關。在所有耳聾患 者中，遺傳性耳聾約占1/2,遺傳性耳聾可分為綜合征型耳聾（SHI)和非綜合征型耳聾 (NSHI)。SHI除了耳聾，還有眼、骨、腎、皮膚等其他病變，NSHI僅有耳聾。學語前耳聾發病 率為1/1000,約半數是遺傳所致，其中70 %為NSHI，30 %是SHI。
[0003] NSHI患者數量較多，可分為常染色體顯性遺傳性耳聾（DFNA3,15%~20% )、常染 色體隱性遺傳性耳聾（DFNBI，80% )、性連鎖（DFNX-linked，1% )和線粒體遺傳性耳聾 (1%)四類，主要相關基因包括6貝2、、6貝6、6邛3、3^：26六4、123冰熟、]^(^六，其中中國最 常見的致聾基因為GJB2、SLC26A4和12SrRNA。GJB2編碼的連接蛋白26(connexin26)異常 被公認為耳聾最常見的病因，表達于耳蝸，在耳蝸毛細胞K+循環中發揮重要作用，其突變 可導致DFNB1和DFNA3。目前，NSHI病人中已發現100多種GJB2突變類型，有4種常見的 突變形式（235delC、299- 300delAT、35delG和176dell6)，約占總突變種類的88%，其中 GJB2235delc是亞洲人中最常見突變。
[0004] SLC26A4基因編碼溶脂蛋白，溶脂蛋白在內耳中表達于內淋巴管、內淋巴囊、橢圓 囊、球囊、血管紋紡錘形細胞、耳蝸外溝和螺旋突起。其轉運功能可以在細胞內外實現C1-/ I-或C1-/HC03-離子互換，突變的SLC26A4基因編碼異常的溶脂蛋白，使其失去正常的離子 轉運功能，致使內淋巴液離子環境失衡，進而導致耳聾。目前發現的SLC26A4基因突變已有 170多種，在中國散發的NSHL兒童中，IVS7-2A>G、2168A>G和1229C>T3種突變類型 發生率最高。線粒體DNA12SrRNA與氨基糖苷類抗生素藥物致聾及NSHL密切相關，常見突 變類型有A1555G和C1494T兩種。由這兩種突變形成的U-A或G-C堿基配對使線粒體DNA 更加容易與氨基糖甙類藥物結合，抑制線粒體的氧化磷酸化過程造成耳毒性，使攜帶者聽 力下降或是原有聽力下降程度更加嚴重。
[0005] GJB3定位于人類染色體1ρ33-p35,編碼有270個氨基酸的連接蛋白 31 (connexin31)。GJB3突變既可導致DFNA又可導致DFNB。GJB3的錯義突變E183K和無 義突變R180X被認為與高頻聽力下降有關。主要突變類型包括R180X、E183K、423delATT、 1141V〇
[0006] GJB6位于13號染色體上，與GJB2緊鄰，其最常見突變是342kb的大片段缺失， 342kb純合缺失或與GJB2單雜合突變共存的雜合缺失會導致感音神經性耳聾。
[0007] ΜΥ0ΤΑ定位于染色體llql3. 5,其突變導致Usher綜合征1B型，同時還與常染色體 顯性和隱性非綜合征耳聾有關，主要突變類型包括R244P、IVS3 - 2A>G35963597ins T。
[0008] 目前，市場上產品常用的篩選耳聾基因的方法有酶切法、變性高效液相色譜 技術（DHPLC)、高分辨率熔解曲線分析（high-resolutionmelt，HRM)和基因芯片。本 發明采用多色熒光PCR法檢測GJB2(235delC、299- 300delAT、176dell6、35delG)，SLC26A4 (IVS7-2A>G、2186A>G)，線粒體12srRNA (A1555G、C1494)，GJB3 (538C>T) 4個耳聾基 因中的9個常見致聾突變位點。
【發明內容】
：
[0009] 本發明目的是利用多色熒光PCR技術提供一種特異性強、靈敏度高、重復性好且 準確度高的遺傳性耳聾基因分型檢測試劑盒。
[0010] 本發明提供的一種遺傳性耳聾基因分型檢測試劑盒，其特征在于：包括PCR反應 液A，檢測遺傳性耳聾基因235delC、299-300delAT、176dell6及內參HBB，PCR反應液B，檢 測遺傳性耳聾基因35delG、IVS7-2A>G、2186A>G及內參HBB，PCR反應液C，檢測遺傳性耳聾 基因A1555G、C1494、538C>T及內參HBB，Taq/UNG酶混合液，陽性對照，陰性對照。
[0011]本發明所涉及的PCR反應液A包括10XPCR buffer、MgCl2、dNTPs、l-200 yM的 235delC的引物和探針、1-200 μΜ的299- 300delAT的引物和探針、1-200 μΜ的176dell6 的引物和探針、1-200 μΜ的HBB的引物和探針及無菌蒸餾水；
[0012] PCR反應液Β包括10XPCR buffer、MgCl2、dNTPs、l-200 μΜ的35delG的引物和 探針、1-200 μ Μ的IVS7-2A>G的引物和探針、1-200 μ Μ的2186A>G的引物和探針、1-200 μ Μ 的ΗΒΒ的引物和探針及無菌蒸餾水；
[0013] PCR反應液C包括10XPCR buffer、MgCl2、dNTPs、1-200 μ Μ的A1555G的引物和探 針、1-200 μ Μ的C1494的引物和探針、1-200 μ Μ的5380Τ的引物和探針、1-200 μ Μ的ΗΒΒ 的引物和探針及無菌蒸餾水；
[0014]具體的10XPCR buffer (l-200mM KCl、l-200mM(NH4)2S04、l-200mM Tris-HCl(pH8.5))、l-25mM MgCl2、dNTPs(l-25mM dATP、卜25mM dGTPU_25mM dCTP、 1-12. 5mM dUTP、1-12. 5mM dTTP混合物）。
[0015] 具體的，
[0016] (l)235delC引物探針為：
[0017]上游引物F1 ;5' -CCAGCATTGGAAAGATCTGGC-3'
[0018]下游引物R1 :5 ' -GCCACTAGGAGCGTGGCGTGGACAC-3 '
[0019]探針P1 :5 ' -FAM-GGAGATGAGCAGGCCGACTTTGTC-BHQ-3 '
[0020] (2)299-300(^1厶1'引物探針為：
[0021]上游引物F2 ; 5 ' -CCAGCATTGGAAAGATCTGGC-3 '
[0022]下游引物R2 :5 ' -GCCACTAGGAGCGTGGCGTGGACAC-3 '
[0023]探針P2 :5 ' -HEX-GAACGTGTGCTACGATCACTACTTC-BHQ-3 '
[0024] (3)l76dell6 引物探針為：
[0025]上游引物F3 ; 5 ' -GCACGCTGCAGACGATCCTG-3 '
[0026]下游引物R3 :5 ' -GCAGGGTGTTGCAGAACAAAGTCG-3 '
[0027]探針P3 :5 ' -R0X-GGAAAGATCTGGCTCACCGTCTT-BHQ-3 '
[0028] (4)內參HBB引物探針為：
[0029]上游引物F4 ; 5 ' -TGAAGGCTCATGGCAAGAAAGT-3 '
[0030]下游引物R4 :5 ' -TTGTCACAGTGCAGCTCACTCA-3 '
[0031]探針P4 :5' -CY5-ACAACCTCAAGGGCACCTTTGCCAC-BHQ-3'
[0032] (5) 35delG引物探針為：
[0033]上游引物F5 ; 5 ' -ATGGATTGGGGCACGCTG-3 '
[0034]下游引物R5 :5 ' -GACCTTCTGGGTTTTGAT-3 '
[0035]探針P5 :5 ' -FAM-ATCCTGGGGGTGTGAA-BHQ-3 '
[0036] (6) IVS72A>G引物探針為：
[0037]上游引物F6 ; 5 ' -GTACGACGGCTTCTCCAT-3 '
[0038]下游引物R6 :5 ' -GACAGTCTTCTCCGTGGG-3 '
[0039]探針P6 :5 ' -HEX-TGGCCTACCGGAGACGAGAAG-BHQ-3 '
[0040] (7) 2186A>G引物探針為：
[0041]上游引物F7 ;5' -TCCGCATCGAAGGCTCCCT-3'
[0042]下游引物R7 :5 ' -AAGATCTGGCTCACCGTCTT-3 '
[0043]探針P7 :5 ' -R0X-GTACGTCTTCTATGTCATGTACG-BHQ-3 '
[0044] (8)A1555G引物探針為：
[0045]上游引物F8 ; 5 ' -CATCAAGGGGGAGATAAAGAG-3 '
[0046]下游引物R8:5 ' -ACGACGGCTTCTCCATGCAGC-3 '
[0047]探針P8 :5 ' -FAM-GGCTCCCTGTGGTGGACCTACACAG-BHQ-3 '
[0048] (9) C1494引物探針為：
[0049]上游引物F9 ; 5 ' -GTGTCCACGCCAGCGCTCCTAGTG-3 '
[0050]下游引物R9 :5 ' -GTGTCCACGCCAGCGCTCCTAGTG-3，
[0051]探針P9 :5 ' -HEX-TGGCCTACCGGAGACGAGAAG-BHQ-3 '
[0052] (10) 5380T引物探針為：
[0053]上游引物F10 ;5' -CTCTTCCTCTACCTGCTGC-3'
[0054]下游引物R10 :5' -GCCCACCATGAAGTAGGTG-3'
[0055]探針P10 :5 ' -R0X-TGGACTGCTACATTGCCTGA-BHQ-3 '
[0056] 本發明所涉及的Taq/UNG酶混合液包括耐熱DNA聚合酶和尿嘧啶DNA糖基化酶。
[0057] 本發明所涉及的陰性對照為含有粘蛋白和BSA的TE緩沖液。
[0058] 本發明所涉及的陽性對照包括遺傳性耳聾基因235delC、299- 300delAT、 176dell6、35delG、IVS72A>G、2186A>G、A1555G、C1494、538C>T和人β -globin的線性化重 組質粒的混合液、粘蛋白和BSA的TE緩沖液。
[0059] 上述方法制造的試劑盒為遺傳性耳聾基因分型檢測試劑盒。優選為一種遺傳性耳 聾基因（9個型）核酸分型檢測試劑盒，主要適用于檢測孕婦臍帶血樣本中遺傳性耳聾基因 (9個型）核酸的存在。
[0060] 本發明的作用和效果
[0061] 本發明提供的試劑盒的使用方法包括以下步驟：
[0062] (1)樣本的采集和保存；
[0063] (2) PCR擴增試劑配制；
[0064] (3)樣本、陰性對照和陽性對照的處理；
[0065] (4)加樣；
[0066] (5) PCR擴增；
[0067] (6)結果分析。
[0068] 本發明利用不同熒光標記的探針，采用同一樣本進行4管PCR擴增的方法，能同 時檢測235(161(：、299-300(161厶1\176(16116、35(1616、1￥572厶>6、2186厶>6、八15556、（：1494、 538C>T和人β-globin，并確定其型別，與現有檢測試劑盒相比，具有以下優勢：
[0069] (1)具有更高的特異性和靈敏度；
[0070] (2)封閉檢測，無需PCR后反應，避免交叉污染和環境污染；
[0071] (3)可實現一管PCR反應檢測多種型別，更簡便和快速；
[0072] (4)分三管擴增能檢測9種遺傳耳聾突變基因，檢測型別多，使用方便。
【附圖說明】：
[0073] 圖1顯示野生型樣本在擴增試劑A中的擴增曲線；
[0074] 圖2顯示陰性對照在3種PCR反應液中的擴增曲線；
[0075] 圖3顯示樣本在擴增試劑B中的擴增曲線。
【具體實施方式】：
[0076] 圖1顯示野生型樣本在擴增試劑A中的擴增曲線，其中橫坐標為PCR循環數，縱坐 標為熒光值；
[0077] 圖2顯示陰性對照在3種PCR反應液中的擴增曲線，其中橫坐標為PCR循環數，縱