抗除草劑基因OsmALS的HRM檢測方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于植物生物技術領域，具體涉及一種水稻抗咪唑啉酮類除草劑基因 OsmALS基因特異性分子標記的開發和應用。
【背景技術】
[0002] 氨基酸是植物體內必不可少的物質，他除了在植物的蛋白質合成中起作用外，在 初級和次生代謝中也發揮著重要的功能。若植物的氨基酸合成受阻，將導致植物代謝紊 舌L從而使植物生長嚴重受損甚至死亡，所以植物的氨基酸合成中的關鍵酶一直是除草 劑研發的熱點。乙酰乳酸合成酶（acetolactatesynthase,ALS),也稱乙酰輕酸合成酶 (acetohydroxyacidsynthase,AHAS),是支鏈氨基酸合成中的一個關鍵酶。在纈j氨酸和亮 氨酸的合成中催化二分子丙酮酸生成乙酰乳酸和二氧化碳，在異亮氨酸的合成中催化一分 子丙酮酸與一分子丁酮酸生成2-乙醛基-2-羥基丁酸和二氧化碳。若ALS活性受到抑制， 將造成支鏈氨基酸合成受阻，進而影響蛋白質合成及植物生長。
[0003] 近些年來，以ALS作為靶標已成為進行分子設計、開發超高效除草劑品種的重要 領域，現已開發出的ALS抑制劑類除草劑有5大類50余種：磺酰脲類（Sulfonylureas,SU)、 咪唑啉酮類（imidazolinones,IMI)、三唑啼陡類（triazolopyrimidines，TP)、啼陡水楊酸 類（pyrimidinylthio-benzoates,PTB)、石黃酉先胺類（sulfonylamino-carbonyl-triazolino nes，SCT)。這些ALS抑制劑類除草劑具有選擇性強、殺草譜廣、低毒高效等特點，其中具有代 表性的是咪唑啉酮類除草劑。此類除草劑主要應用于大豆等豆科作物的重要品種，對玉米、 小麥、水稻等禾本科作物的重要品種無選擇性，并且在使用中，由于其土壤的長殘留往往造 成后茬多種作物受害。隨著抗性作物的選育成功，這個問題得到了解決。目前，已將抗性作 物與咪唑啉酮類除草劑使用組成一種"Clearfield生產體系"，即種植抗咪唑啉酮作物并使 用咪唑啉酮類除草劑來防治其他除草劑所不能防治的某些特殊雜草，如抗咪唑啉酮水稻田 的赤稻、油菜田的野油菜與其它十字花科雜草等。
[0004] 獲得ALS抗除草劑突變體材料后，通過雜交、回交等常規育種方法，可將該抗除草 劑新品系的抗性基因導入其它對咪唑啉酮類除草劑無抗性的水稻品種或品系，提高導入目 標品種或品系對咪唑啉酮類除草劑的耐受性。若將抗性基因導入恢復系后，F1真雜種便具 有抗咪唑啉酮類除草劑特性，通過噴施除草劑可將各種類型的假雜種一次性全部殺死，提 高了制種效率和種子純度。但是抗性性狀為顯性性狀，F1代表現為咪唑啉酮抗性，從F2代 開始分離，在田間選育中需要開始每代噴施除草劑進行鑒定，如果除草劑劑量使用不當或 噴施不均勻極可能導致誤選或所需要的材料死亡。另外，在抗除草劑基因研究過程中有時 需要保存不抗的材料，用作比較研究。為此，若能找到與抗性基因共顯性的分子標記，從而 進行標記輔助選擇，區分出育種材料中抗性基因的不同基因型，則可指導田間選育，加快育 種進程。
【發明內容】
[0005] 為了能更簡便、更快速有效地檢測出水稻材料中是否含有抗咪唑啉酮類除草劑基 因OsmALS突變體，并將其應用到抗性育種過程中，本發明提供了一種基于HRM技術，用于檢 測水稻抗咪唑啉酮類除草劑基因OsmALS的第548位氨基酸突變的方法，所述OsmALS基因 的第548位氨基酸突變包括但不限于由Trp突變為Cys或Met，或是在該位置發生堿基的取 代、缺失或添加一個或幾個核苷酸。所述的突變可以是點突變，也可以是DNA缺失或插入突 變。所述突變可以通過化學誘變或基因定點突變的方式獲得，化學誘變的方法包括用EMS 等誘變劑處理所導致的誘變；基因定點突變的方法包括但不限于ZFN定點突變方法、TALEN 定點突變方法、和/或CRISPR/Cas9等定點突變方法。對該位點堿基突變檢測方法的開發， 可以提高該基因在分子標記輔助選擇育種，基因聚合育種，以及轉基因育種中應用的效率。
[0006] 具體地，上述水稻OsALS基因的第548位氨基酸由Trp (TGG)突變為Met(ATG)的 點突變，該點突變后的OsmALS基因的DNA序列如SEQ ID NO: 1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。通過設計特定的檢測引物，檢測候選材料中該位置的堿基存在狀態，具體通過 分析其HRM溶解曲線從而了解植株內源是否含有該突變，及所述突變為純合還是雜合狀態 的一種檢測方法。
[0007] 本發明通過多輪實驗，還優化出了一對用于OsmALS的第548位突變的HRM檢測的 特定引物，所述引物編號及序列是：ALS-22415F:5' -AAGTATGTATGCGCCCT-3' ；ALS-22494R: 5' -GTGTTGAACAACCAACA-3'。
[0008] 本發明HRM檢測方法采用10μL反應體系，包含1μLPCR模板，0. 5UrTaqDNA 聚合酶（Takara，Japan)，lXPCR緩沖液（含Mg2+)，250yMdNTP，0.ΙμΜ正向和反向引物 和 0· 1μL20XEvaGreen熒光染料（Biotium，USA)。PCR擴增程序為 95°C3min;94°C30s， 58°C30s，72°C10s，40 個循環；72°C5min，緊接著 95°C變性lmin，25°C復性lmin。為了防 止蒸發，體系務必滴加15μL礦物油覆蓋。
[0009] 本發明所提供的HRM檢測方法的實驗步驟是：a)提取待測樣本DNA;b)配制包含 待測樣本DNA、引物對和EvaGreen熒光染料的PCR反應體系進行PCR擴增；和c)對PCR產 物進行HRM分析掃描。
[0010] 本發明還提供了一種提取植物細胞、組織、或器官中基因組DNA的方法，所述方法 包括：取適量植物細胞、組織或器官等材料，直接加提取液（10mMTris-HCl、0. 5mMEDTA、 0. 15MKC1)研磨，沸水浴10min后，靜置分層取上清，即獲得其基因組DNA，可作為HRM檢測 中的PCR模板。
[0011] 本發明還提供了一種基于HRM技術的水稻OsmALS基因第548位突變檢測PCR試 劑盒，其特征在于所述試劑盒包含引物對：正向引物：AAGTATGTATGCGCCCT(SEQIDN0:3); 和反向引物：GTGTTGAACAACCAACA(SEQIDN0:4)，用于檢測ALS的Trp548Met突變。
[0012] 更具體的，本發明所提供的試劑盒進一步包含PCR試劑和熒光染料。
[0013] 本發明還提供了一種試劑盒的使用方法，所述試劑盒的使用方法包括如下步驟： 提取待測樣本DNA;配制包含待測樣本DNA、引物對、PCR試劑盒和EvaGreen熒光染料的PCR 反應體系進行PCR擴增；和對PCR產物進行HRM分析掃描。
[0014] 具體地，本發明所述的檢測水稻抗咪唑啉酮類除草劑基因OsmALS基因第548位 點突變分子標記的方法如下：通過使用引物對ALS-22415F和ALS-22494R對待檢測材料的 基因組DNA進行PCR擴增；用LightScanner96等高分辨率熔解曲線分析儀器對前述PCR 擴增產物進行高分辨率熔解曲線采集后，所獲得的與陽性對照水稻抗咪唑啉酮類除草劑基 因OsmALS呈一致的特異性峰型高分辨率熔解曲線，即可確定該材料具有水稻ALS基因的第 548位突變。
[0015] 所述引物對ALS-22415F和ALS-22494R的核苷酸序列如下所示：
[0016] ALS-22415F :5'-AAGTATGTATGCGCCCT-3'（SEQ ID N0:3);
[0017] ALS-22494R :5' -GTGTTGAACAACCAACA-3'（SEQ ID N0:4);
[0018] 所述的與水稻抗咪唑啉酮類除草劑基因OsmALS呈特異性峰型的高分辨率熔解曲 線具體如圖2的紅色曲線所示；在實際應用時，只需所檢測樣品的高分辨率熔解曲線與水 稻非轉基因抗除草劑材料D3-10的高分辨率熔解曲線一致即可；
[0019] 所述的水稻抗咪唑啉酮類除草劑基因OsmALS基因的第548位突變的HRM檢測方 法的開發，包括以下步驟：
[0020](1)通過多序列比對軟件工具（如DNAMAN)，對野生型黃華占ALS基因（L0C_ 0s02g0510200)與水稻非轉基因抗除草劑材料的OsmALS基因（的編碼區第548位氨基酸對 應的核苷酸進行比對分析，篩查OsmALS基因的第548位氨基酸突變情況；
[0021] (2)利用步驟⑴獲得的SNP信息，在該SNP上游36bp處設計基因特異性上游引 物，在該SNP下游44bp處設計基因特異性下游引物，引物對堿基序列如下：
[0022] ALS-22415F :5'-AAGTATGTATGCGCCCT-3'（SEQ ID N0:3);
[0023] ALS-22494R :5' -GTGTTGAACAACCAACA-3'（SEQ ID N0:4);
[0024] (3)以攜帶有水稻抗咪唑啉酮類除草劑基因OsmALS的咪唑啉酮類除草劑抗性材 料的總DNA為模板，進行PCR擴增，所獲得的PCR產物用LightScanner96等高分辨率熔解 曲線分析儀器進行高分辨率熔解曲線采集后，得到與水稻抗咪唑啉酮類除草劑基因OsmALS 呈特異性峰型的高分辨率熔解曲線，即為水稻抗咪唑啉酮類除草劑基因OsmALS基因第548 位突變特異性分子標記；
[0025] 所述的水稻抗咪唑啉酮類除草劑基因OsmALS基因特異性分子標記548突變在鑒 別水稻材料咪唑啉酮類除草劑抗性基因的應用，特別適合