一種快速檢測樣品中靶核酸的方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于核酸檢測領域，具體涉及一種快速檢測樣品中靶核酸的方法。
【背景技術】
[0002] 核酸分子雜交（簡稱分子雜交，hybridization)是核酸研究中一項最基本的實驗 技術，其基本原理就是應用核酸分子的變性和復性的性質，使來源不同的DNA(或RNA)片 段，按堿基互補關系形成雜交雙鏈分子。雜交雙鏈可以在DNA與DNA鏈之間，也可在RNA與 DNA鏈之間形成。目前，分子雜交技術已經成為現代分子生物學實驗室中最常用的非放射性 基因診斷技術之一，其不僅可用來檢測引起癌變的基因突變和引起各種遺傳性疾病（如地 中海貧血）的基因突變，而且可用來檢測引起感染性疾病的細菌、病毒和寄生蟲等。
[0003] 按照反應進行的環境不同，分子雜交可分為固相雜交和液相雜交兩種類型。按照 在實驗室內不同應用目的，分子雜交又可分為斑點（或狹縫）雜交、Southern印跡雜交、 Northern雜交、細胞以及染色體原位雜交等。
[0004] 固相分子雜交是將參加反應的一條核酸鏈先固定在固相支持物上，一條反應核酸 游離在溶液中。按照被檢測樣品分子所在位置不同，固相分子雜交可分為正向雜交（待測 樣品分子固定在膜上，檢測探針在溶液中）和反向雜交（待測樣品分子在溶液中，而探檢測 針固定在膜上）兩種。其中，反向雜交是指用標記的樣品核酸與未標記的固化核酸探針進 行雜交。這種雜交方法的優點是在一次雜交反應中，可同時檢測樣品中的多種核酸。
[0005] 現有的反向雜交技術操作繁瑣，涉及的反應溶液和反應步驟眾多，尤其當涉及檢 測多個樣品時，操作時間將會大大加長而且極易出錯。例如，中國專利申請CN101768628A 中公開了一種檢測核酸點突變的方法，具體公開了一種利用寡核苷酸探針對PCR產物進行 反向雜交以檢測核酸點突變的方法，但是該方法需要借助價格高昂熒光檢測設備進行雜交 結果的測試，不僅操作繁瑣，而且成本較高。因此，亟需要一種快速檢測樣品中靶核酸的方 法。
[0006] 出于這種考慮，本發明的發明人進行了研究，目的是解決相關領域現有技術所暴 露出來的問題，期望提供一種耗時短、易操作、高通量、成本低的快速檢測樣品中靶核酸的 方法以及其在檢測結核分枝桿菌耐藥基因中的應用。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的之一在于提供一種快速檢測樣品中靶核酸的方法，該方法一方面將 核酸反向分子雜交過程與酶聯過程合二為一進行，可以在固相支持物表面直接形成堿性磷 酸酶標記標記核酸雜交體的偶聯物；另一方面將洗滌與顯色反應合二為一進行，直接在顯 色溶液中通過酶促反應使底物形成有色產物而顯色，從而在雜交反應后無需經過單獨的洗 滌步驟就可以快速實現樣品中靶核酸檢測的目的。
[0008] 本發明的又一目的在于提供所述方法在檢測結核分枝桿菌耐藥基因中的應用。
[0009] 根據本發明的一個方面，本發明提供了一種檢測樣品中靶核酸的方法，其包括如 下步驟：
[0010] A)將固定于固相支持物表面的至少一種核酸探針在包含堿性磷酸酶標記鏈霉親 和素的雜交液中與生物素標記的靶核酸進行一步反應；
[0011] B)步驟A)中反應完成后，直接將固相支持物表面與包含底物的顯色溶液接觸進 行顯色反應，以檢測樣品中的靶核酸。
[0012] 本發明的方法直接將堿性磷酸酶標記鏈霉親和素加入到雜交液中，在核酸探針與 靶核酸雜交的過程中，同步實現了堿性磷酸酶標記鏈霉親和素與生物素的結合過程，從而 可以在固相支持物表面形成堿性磷酸酶標記核酸雜交體的偶聯物，省去了傳統反向分子雜 交方法中在雜交反應后需要單獨進行酶聯反應的步驟以及其他多個操作步驟，極大縮短了 傳統方法檢測靶核酸的耗時。
[0013] 在本發明的方法中，所述堿性磷酸酶是一種同源二聚體蛋白，是一種含鋅的金屬 酶。每分子酶至少含2個Zn原子。酶上包含3種類型的金屬結合位點，即所謂的催化結合 位點、結構結合位點和調節結合位點。其中兩個催化結合位點的結合則只會導致一個亞單 位的磷酸化，即負協作亞單位之間發生相互作用。
[0014] 在本發明的方法中，所述生物素有兩個環狀結構I和II。其中，I環為咪唑酮環， 是其與鏈霉親和素結合的主要部位；II環為噻吩環，C2上有一戊酸側鏈；生物素分子通過 其末端的羧基與本發明所述的靶核酸連接，從而標記在靶核酸分子上。
[0015] 在本發明的方法中，所述鏈霉親和素是由鏈霉菌分泌的一種蛋白質，其分子由4 條相同的肽鏈組成，每條肽鏈都能結合一個生物素，因此每個鏈霉親和素分子能結合4個 生物素分子。此外，每條肽鏈的氨基酸組成中，甘氨酸和丙氨酸的含量較大，肽鏈中的色氨 酸殘基是連接生物素的活性基團。所述鏈霉親和素與生物素二者親和結合的常數（K)為 1015L/mol。在本發明的方法中，靶核酸與核酸探針雜交的同時，鏈霉親和素與生物素也進 行親和結合，因此雜交液中的堿性磷酸酶標記鏈霉親和素分子與固定在固相支持物表面的 核酸探針分子在一步反應中競爭性結合生物素標記的靶核酸分子。
[0016] 本發明的發明人經過大量實驗與創造性勞動發現，在本發明的方法中，將所述堿 性磷酸酶標記鏈霉親和素直接加入到雜交液中，一方面能夠使得堿性磷酸酶標記鏈霉親和 素與生物素標記靶核酸充分的結合；另一方面還能夠促進核酸雜交效率，縮短核酸雜交反 應的時間。
[0017] 根據本發明的一個具體實施例，步驟A)中所述堿性磷酸酶標記鏈霉親和素在雜 交液中的濃度為〇· 05~2μg/ml，優選0· 1~1. 5μg/ml，更優選0· 5~1. 2μg/ml。在 本發明的方法中，可以列舉的所述堿性磷酸酶標記鏈霉親和素在雜交液中的濃度包括但不 限于：〇· 05μg/ml、0. 06μg/ml、0. 07μg/ml、0. 08μg/ml、0. 09μg/ml、0. 1μg/ml、0. 2μg/ ml、0. 3μg/ml、0. 4μg/ml、0. 5μg/ml、0. 6μg/ml、0. 7μg/ml、0. 8μg/ml、0. 9μg/ml、 1μg/ml、L1μg/ml、L2μg/ml、L5μg/ml和 2μg/ml〇
[0018] 在本發明的方法中，所述堿性磷酸酶標記鏈霉親和素在雜交液中的濃度是本發明 的重要方面。本發明的發明人經過大量試驗與創造性勞動發現，如果堿性磷酸酶標記鏈霉 親和素在雜交液中的濃度過低，那么影響靶核酸檢測的靈敏度；如果堿性磷酸酶標記鏈霉 親和素在雜交液中的濃度過高，那么容易帶來非特異性吸附現象，影響靶核酸檢測結果的 準確性。
[0019] 根據本發明的一個具體實施例，步驟A)中所述雜交液包括鋅離子、鎂離子、蛋白、 非離子型表面活性劑和陽離子型聚合物；其中，所述蛋白選自白蛋白、酪蛋白和明膠，所述 非離子型表面活性劑選自吐溫和曲拉通，所述陽離子型聚合物選自陽離子聚丙烯酰胺、多 聚賴氨酸和聚合氯化鋁。
[0020] 根據本發明的一個具體實施例，在所述雜交液中，鋅離子為0. 001~0.lmol/L，鎂 離子為0. 001~0.lmol/L，蛋白占雜交液的1%~10% (w/v)，非離子型表面活性劑占雜交 液的0. 01~2% (v/v)，陽離子型聚合物占雜交液的0. 01~0. 5% (w/v);優選地，鋅離子 為0· 005~0· 05mol/L，緩離子為0· 005~0· 05mol/L，蛋白占雜交液的1 %~5 % (w/v)，非 離子型表面活性劑占雜交液的〇. 05~1 % (v/v)，陽離子型聚合物占雜交液體積的0. 05~ 0. 2% (w/v) 〇
[0021] 根據本發明的一個具體實施例，所述鋅離子可以選自含鋅離子的可溶性鹽。可用 作本發明的所述含鋅離子的可溶性鹽的實例包括：硫酸鋅、氯化鋅以及其他各種在溶液狀 態可以解離出鋅離子的鹽。
[0022] 根據本發明的一個具體實施例，所述鎂離子可以選自含鎂離子的可溶性鹽。可用 作本發明的所述含鎂離子的可溶性鹽的實例包括：硫酸鎂、乙酸鎂、氯化鎂以及其他各種在 溶液狀態可以解離出鎂離子的鹽。
[0023]根據本發明的一個具體實施例，所述吐溫選自吐溫20 (Tween-20)、吐溫 21(Tween-21)、吐溫 40(Tween-40)、吐溫 60(Tween-60)、吐溫 61(Tween-61)、吐溫 80 (Tween-80)、吐溫81 (Tween-81)和吐溫85 (Tween-85)，其中吐溫20是特別優選的。
[0024]根據本發明的一個具體實施例，所述曲拉通選自曲拉通X-100(TritonX-100)、曲 拉通X-114(TritonX-114)和曲拉通X-200(TritonX-200)，其中，曲拉通X-100是特別優 選的。
[0025] 本發明的發明人經過大量實驗與創造性勞動發現，在本發明的方法中，酸、堿、鹽 離子或溫度條件的變化都可能會改變甚至使堿性磷酸酶完全失去活性，因此為了實現本發 明的目的之一，雜交液成分的選擇是極為重要的。在本發明的方法中，發明人通過在雜交液 中添加鋅離子、鎂離子、蛋白和非離子型表面活性劑，一方面有助于提高核酸雜交效率，另 一方面防止雜交液中的堿性磷酸酶標記鏈霉親和素因吸附而變性，再一方面防止堿性磷酸 酶