食品和餐飲具中單增李斯特菌快速檢測冷水凝膠試紙片及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物安全檢驗檢測技術領域，具體涉及一種快速檢測紙片，更具體 地說，本發明涉及一種專門用于食品和餐飲具中快速檢測單增李斯特菌的定性和定量檢測 的冷水凝膠試紙片及其制備方法與應用。
【背景技術】
[0002] 單增李斯特菌分布較廣，單增李斯特菌是唯一能引起人類疾病的。單核增生李斯 特菌（Listeriamonocytogenes)是一種常見的土壤細菌，在土壤中它是一種腐生菌，以死 亡的和正在腐爛的有機物為食。它也是某些食物（主要是鮮奶產品）中的一種污染物，能 引起嚴重食物中毒。單核細胞增生李斯特氏菌是一種人畜共患病的病原菌。它能引起人、 畜的李氏特菌病，感染后主要表現為敗血癥、腦膜炎和單核細胞增多。它廣泛存在于自然界 中，食品中存在的單增李氏菌對人類的安全具有危險，該菌在4°C的環境中仍可生長繁殖， 是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一。單增李斯特菌是評價食品衛生質量的重要指 標之一，目前已被國內外廣泛應用于食品衛生工作中。我國已將其納入"國家標準"。國標 方法檢測單增李斯特菌需要配制新鮮培養基，操作方法繁瑣，成本較高，檢測時間長，達不 到快速一步法檢測。因此，業內一直希望能有一種經濟、簡便、易行、快速、準確的方法和產 品。
[0003] 紙片法是上世紀80年代發展起來的一種快速檢測食品及食品接觸的物體表面、 餐具、茶具中單增李斯特菌污染情況的方法。目前，國內外對單增李斯特菌檢測研究較多， 基于分子生物學檢測方法，如PCR方法、LAMP法等；基于膠體金檢測法；基于ELISA檢測法； 特異性顯色培養法等。但上述方法需要特殊的檢測設備，不便于日常現場快速檢測需求。 申請號為201510274726. 9的專利申請公開了一種"快速檢測單增李斯特菌的檢測試紙及 其制備和應用"，該檢測試紙整體呈矩形，包括加樣區，底物區及顯色區三個功能區，相鄰兩 區之間設置著流體通道，在底物區邊界中設置著含有底物5-溴-4-氯-3-吲羥肌醇磷酸銨 X-InP的底物層，但是該現有技術中公開的檢測試紙主要用于飲用水、肉食品、乳制品、蔬菜 中單增李斯特菌污染的定性檢測，不能用于餐飲具表面單增李斯特菌的檢測，且該檢測試 紙只能進行定性檢測，無法滿足定量檢測需求。
【發明內容】
[0004] 為了克服【背景技術】中所指出的問題及現有技術存在的已有檢測產品和檢測方法 的不足，本發明的第一個目的在于提供一種專用于食品和餐飲具中快速檢測單增李斯特菌 并可定性、定量分析的冷水凝膠試紙片。該試紙片不僅適合于多種食品中單增李斯特菌的 檢測，也可用于餐飲具中單增李斯特菌的快速檢測。且該試紙片檢測方法操作簡便易行、快 速準確（一步法），特異性強，敏感性高，成本低廉，便于基層單位特別是邊沿地區及條件差 的基層試驗室使用。另外，本發明還提供了一種上述所述冷水凝膠試紙片的制備方法與應 用。
[0005] 為了實現本發明的第一個目的，發明人通過大量試驗研究和不懈探索，最終獲得 了如下技術方案：
[0006] -種單增李斯特菌快速檢測冷水凝膠試紙片，所述試紙片中含有混合培養 基，所述混合培養基由基礎培養基、顯色劑和冷水凝膠組成，所述顯色劑的名稱為 (2R，3S，4R，5R，6R) -1，2, 3,4, 5-五羥基環己基-(2-硝基-4-氟苯基）磷酸酯，分子量為 398,所述顯色劑的結構式如式一所示：
[0007]
[0008] 進一步地，上述技術方案中所述的顯色劑（21?，33,41?，51?，61?)-1，2,3,4,5-五羥基 環己基-(2-硝基-4-氟苯基）磷酸酯采用如下方法制備而成，包括如下步驟：
[0009] (1)將反應物A溶于無水二異丙胺及少量無水氯仿中，得到反應物A體系，然后將 所述反應物A體系置于-70~-80°C條件下冷凍；
[0010] (2)在低溫-70~-80°C低溫條件下，將反應物B在無水、氮氣氛圍中逐滴加入到 反應物A體系中，劇烈攪拌，反應5. 5~6. 5h;
[0011] (3)將步驟（2)反應后的體系置于室溫環境中，待反應體系達到室溫后，繼續向體 系中加入溶有反應物C的無水氯仿溶液，室溫繼續攪拌反應12~14h，生成亞磷酸酯類物 質；
[0012] (4)在步驟（3)反應后的體系中加入叔丁基過氧化氫，將亞磷酸鹽氧化，并將得到 的磷酸鹽置于三甲胺中，在50±0. 5°C條件下放置22~24h;
[0013] (5)除去三甲胺，得到粗產物后，再加入乙硫醇和三氟化硼-醚溶液進行去保護反 應，最終得到的目標產物即為所述顯色劑，其中，所述反應物A為1，2,3,4,5,6-六甲氧基亞 甲基-肌醇，反應物B為二氯亞磷酸甲酯，反應物C為2-硝基-4-氟苯酚。
[0014] 進一步地，上述技術方案中所述反應物A、反應物B、反應物C的用量摩爾比為 1:1. 25:2〇
[0015] 進一步地，上述技術方案步驟（1)中所述反應物A與無水二異丙胺的用量摩爾比 為 1:2. 5〇
[0016] 上述所述顯色劑在制備過程中發生的化學反應方程式如式二所示：
[0017]式二
[0018] 進一步地，上述技術方案中所述基礎培養基由胰蛋白胨、牛肉粉、多價胨、氯化納、 磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、甘氨酸、氯化鋰、苯乙醇、七葉苷組成；所述冷水凝膠由聚丙烯酸 鈉、黃原膠和海藻糖組成。
[0019] 進一步地，上述技術方案中每升所述混合培養基中含有胰蛋白胨5. 0~6.0g、牛 肉粉5. 0~6. 0g、多價胨3. 0~5. 0g、氯化納8.0~10. 0g、磷酸二氫鉀1. 0~1. 5g、磷酸 氫二鈉5. 0~7.Og、甘氨酸8. 0~10.Og、氯化鋰1. 0~2.Og、苯乙醇2. 0~3.Og、七葉苷 1· 0~1. 5g;顯色劑（2R，3S，4R，5R，6R) -1，2, 3,4, 5-五羥基環己基-(2-硝基-4-氟苯基） 磷酸酯2. 0~2. 5g;聚丙稀酸鈉4. 0~6.Og、黃原膠1. 0~3.Og、海藻糖2. 0~4.Og。
[0020] 本發明的另一目的在于提供一種上述所述單增李斯特菌快速檢測冷水凝膠試紙 片制備方法，所述方法包括如下步驟：
[0021] (1)載體紙片制備：將層析濾紙剪切成5cmX5cm規格，經輻照或高壓滅菌，高壓滅 菌后于50°C恒溫真空干燥后備用；
[0022] (2)內包裝袋：將耐高溫的聚丙烯塑料薄膜袋，按試驗要求壓合成5. 2cmX5. 2cm 規格的聯袋；
[0023] (3)基礎培養基配制：每升混合培養基中含有胰蛋白胨5.0~6. 0g、牛肉粉5.0~ 6. 0g、多價胨3. 0~5. 0g、氯化納8. 0~10. 0g、磷酸二氫鉀1. 0~1. 5g、磷酸氫二鈉5. 0~ 7. 0g、甘氨酸8. 0~10. 0g、氯化鋰1. 0~2. 0g、苯乙醇2. 0~3. 0g、七葉苷1. 0~1. 5g;
[0024] (4)每升培養基中含有顯色劑（2R，3S，4R，5R，6R) -1，2, 3, 4, 5-五羥基環己 基-(2-硝基-4-氟苯基）磷酸酯2. 0~2. 5g;
[0025] (5)冷水凝膠配制：0·4~0·6%聚丙烯酸鈉、0·1~0·3%黃原膠和0·2~0·4% 海藻糖，所述百分比均為質量體積百分比；
[0026] (6)混合培養基配制：將基礎培養基、顯色劑和冷水凝膠混合均勾，加去離子水定 容至1000ml，于115°C、高壓條件下滅菌15min，調節pH至7. 2~7. 4;
[0027] (7)試紙片制作：將滅菌載體紙片依次放入滅菌的燒杯中，加入40°C~45°C的混 合培養基使之淹沒紙片，浸泡8~10min，使培養基充分吸附于紙片，擺放于無菌不銹鋼絲 網上，45 °C恒溫真空干燥；
[0028] (8)試紙片包裝：將浸漬烘干的紙片，無菌操作裝入無菌的塑膜袋內，其中 5cmX5cm的紙片，每袋1張，再裝入鋁鈾袋，封口后室溫以下保存備用。
[0029] 本發明的還一目的在于提供上述所述的單增李斯特菌快速檢測冷水凝膠紙片的 應用。
[0030] 如上所述的一種單增李斯特菌快速檢測冷水凝膠紙片，所述試紙片可同時適用于 食品和餐飲具中單增李斯特菌的定量、定性檢測。
[0031] 與現有技術相比，本發明具有以下優點：
[0032] 1、本發明適用于食品和餐飲具中單增李斯特菌定量和定性檢測分析，本發明利用 冷水凝膠以層析濾紙為載體，將培養基成分、顯色劑和冷水凝膠混合，均勻地負載到層析濾 紙上，樣品可均勻分布于冷水凝膠，在其表