一種提高甘油酯型魚油中epa和dha含量的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種提高魚油中EPA和DHA含量的方法，特別涉及一種以甘油酯型魚 油和乙酯型魚油為反應底物，在米曲霉脂肪酶的作用下進行酯酯交換反應以提高甘油酯型 魚油中EPA和DHA含量的方法。 (二）
【背景技術】
[0002] 順式-5, 8, 11，14, 17-二十碳五烯酸（EPA)和順式-4, 7, 10, 13, 16, 19-二十二碳 六烯酸（DHA)是兩種重要的n-3多不飽和脂肪酸（PUFA)，對人體有重要的營養保健功效。 天然存在的魚油中的EPA和DHA含量較低，而且EPA和DHA的甘油酯型易被人體消化吸收， 因此制備高含量的EPA和DHA甘油酯魚油產品成為該領域的研究熱點。傳統的物理化學法 制備高純度甘油酯EPA/DHA的方法包括低溫結晶法，金屬鹽沉淀法，超臨界流體萃取法等。 通常理化條件下長鏈H-3PUFA中的全順式雙鍵結構易發生順反異構、氧化、聚合和雙鍵的 位移等反應。
[0003] 生物酶法由于其反應條件溫和、步驟簡單、環境友好、效率高等優點，成為富集高 純度的甘油酯型EPA/DHA的主要研究方向。目前文獻報道的包括水解、醇解、甘油解、酸 解、酯酯交換、酯化等路徑。這些方法均能在一定程度上提高甘油酯中EPA和DHA的含量， 但這些方法的商品化脂肪酶的用量大，生產成本高，因而限制了其工業化生產。國產鍉魚 魚油EPA\DHA含量為25%左右，要低于進口魚油EPA\DHA30%含量，一般魚油保健品產品 EPA\DHA含量為30% (其中EPA含量18%，DHA含量12% )，因此國產魚油較少用于魚油保 健品的制備，而主要用于飼料工業。 (三）
【發明內容】
[0004] 本發明目的是為了解決上述方法的不足，通過篩選產脂肪酶微生物，提供了一種 廉價高效的脂肪酶，以甘油酯型魚油和乙酯型魚油為反應底物，在米曲霉脂肪酶的作用下 進行酯酯交換反應合成高含量EPA\DHA甘油酯型魚油的方法。酶法酯酯交換反應機理（如 圖1):魚油甘油酯中1，3位EPA\DHA含量較低，通過1，3位特異性米曲霉脂肪酶的催化酯 酯交換反應可以提高產物甘油酯中的EPA\DHA含量。
[0005] 本發明采用的技術方案是：
[0006] 本發明提供一種提高甘油酯型魚油中EPA和DHA含量的方法，所述方法為：以米 曲霉（AspergillusoryZae)WZ007發酵培養獲得的濕菌體用pH值為7. 0的磷酸緩沖液懸 浮后冷凍干燥制成的米曲霉WZ007凍干菌體為催化劑，以甘油酯型魚油和乙酯型魚油為底 物，在無溶劑體系中30~80°C、200rpm條件下進行反應（優選反應6~24小時），通過氣 相色譜儀監控乙酯型魚油中EPA和DHA總含量的變化，當EPA和DHA總含量穩定不變后，結 束反應，將反應液過濾，濾餅回收生物催化劑，濾液分離純化，獲得提高EPA和DHA含量的甘 油酯型魚油；所述底物甘油酯型魚油中EPA和DHA質量總含量為18% -30%，其中EPA質量 含量為9% -21%，DHA質量含量為9% -20% ;所述底物乙酯型魚油中EPA和DHA質量總含 量為50% -70%，其中EPA質量含量為30% -40%，DHA質量含量為20% -30%。
[0007] 進一步，反應體系為無溶劑體系，所述甘油酯型魚油用量以甘油酯物質的量計， 所述乙酯型魚油用量以乙酯物質的量計，所述甘油酯與乙酯物質的量之比1:2_1:5,優選 1:3,催化劑加入量以底物體積（即甘油酯型魚油和乙酯型魚油總體積）計為50~200g/L， 優選 100 ~150g/L。
[0008] 進一步，所述米曲霉WZ007凍干菌體按如下方法制備：（1)斜面培養：將米曲霉 WZ007接種至斜面培養基，30°C培養3天，作為斜面活化種子；斜面培養基質量終濃度組成： NaN03 0· 1 ~0· 3%，K2HP04 0· 1 ~0· 2%，KC1 0· 3 ~0· 7%，FeS04 0· 001 ~0· 002%，MgS04 0.04~0.06%，蔗糖2~5%，瓊脂1.5~2.0%，溶劑為去離子水，pH自然；優選斜面培養 基質量終濃度組成：NaN03 0.2%，Κ2ΗΡ04 0.1%，KC1 0.5%，FeS04 0 . 001%，MgS04 0 . 05%， 蔗糖3%，瓊脂1.5%，溶劑為去離子水，pH自然；
[0009] (2)發酵培養：將斜面種子接種至液態發酵培養基，30~37°C、搖床轉速150~ 200r/min條件下培養2~3天，過濾得到菌絲體；液態發酵培養基終濃度組成為：葡萄糖 20 ~60g/L，蛋白胨 20 ~50g/L，蔗糖 10 ~60g/L，尿素 3 ~9g/L，NaCl4 ~8g/L，Κ2ΗΡ04 2~5g/L，MgS04 1~3g/L，（NH4) 2S04 4~8g/L，溶劑為去離子水，pH自然；優選液態發酵培 養基終濃度組成為：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，蔗糖10g/L，尿素3g/L，NaCl5g/L，K2HP04 2g/L，MgS04lg/L，（NH4)2S04 5g/L，溶劑為去離子水，pH自然；
[0010] (3)凍干菌體制備：將步驟（2)米曲霉WZ007經發酵培養過濾獲得的濕菌體懸浮 在pH值為7. 0磷酸緩沖液（緩沖液用量能夠將濕菌體浸沒即可，優選緩沖液用量為2ml/g 濕菌體）中，-20~0°C冷凍干燥48h后，獲得米曲霉WZ007凍干菌體。
[0011] 進一步，本發明所述甘油酯型魚油為鍉魚魚油（EPA質量含量11%，DHA質量含量 14%)，沙丁魚魚油（EPA質量含量18%，DHA質量含量12%)或金槍魚魚油（EPA質量含量 9%，DHA質量含量20% )。
[0012] 進一步，本發明所述乙酯型魚油按如下方法制備：將沙丁魚魚油通過化學法完全 醇解合成乙酯型魚油，分子蒸餾和尿素包埋法獲得EPA和DHA總含量50 % -70 %的乙酯型 魚油產品。具體優選方法為：以EPA質量含量21%，DHA質量含量9%的沙丁魚乙酯型魚油 為原料，在POPE2inchWFS分子蒸餾儀（美國POPE科學公司）進行分子蒸餾，蒸餾結束后， 收集目標餾分，再以質量比1:2加入尿素進行尿素包埋，制備得到EPA質量含量38%，DHA 質量含量28 %的乙酯型魚油，其中分子蒸餾條件：蒸餾溫度90°C、預熱溫度40°C、內冷溫度 15°C、刮膜器轉速360r/min、進料速率2mL/min、真空度0.IPa的條件下對乙酯化魚油進行 富集。尿素包埋條件：尿素/乙酯化魚油的質量比2 : 1，結晶溫度3°C，包合時間18h。
[0013] 進一步，本發明所述乙酯型魚油中EPA和DHA總質量含量60 % -70 %，其中EPA質 量含量為35 % -40 %，DHA質量含量為25 % -30 %，最優選EPA質量含量38 %，DHA質量含 量 28%。
[0014] 本發明所述米曲霉（Aspergillusoryzae)WZ007,保藏于中國典型培養物保藏中 心，保藏編號CCTCCNo:M206105,保藏日期2006年10月8日，已在ZL200610154832. 4申 請中公開。所述米曲霉WZ007由土壤中篩選得到，通過發酵得到濕菌體，干燥等處理后得到 酶制劑用于酶法合成高含量EPA\DHA甘油酯型魚油，其中鍉魚魚油EPA\DHA含量可以從初 始 20-25 % 提高到 40-55 %。
[0015] 與現有技術相比，本發明有益效果主要體現在：本發明克服了化學方法反應條件 苛刻，副廣物多，分尚步驟多，能耗大等不足，以及商品酶法催化劑成本尚等缺點。
[0016] 本發明所述提高甘油酯型魚油中EPA和DHA含量的方法中所用米曲霉脂肪酶具 有很強酯交換活性，反應轉化率高，鍉魚魚油EPA和DHA總含量可以從初始20-25 %提高到 40-55 %，全細胞生物催化劑可以重復利用，下游分離簡單，能耗低，生產成本低，環境污染 小，適合工業化生產。 (四）
【附圖說明】
[0017] 圖1脂肪酶催化酯酯交換反應合成高含量EPA\DHA甘油酯。 (五）
【具體實施方式】
[0018] 下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于 此：
[0019] 實施例1 :
[0020] 斜面培養：將米曲霉（Aspergillusoryzae)WZ007 (保藏編號CCTCCNo.Μ 206105)接種至斜面培養基，30°C培養3天，作為斜面活化種子。斜面培養基質量終濃度組 成：NaN03 0· 2%，Κ2ΗΡ04 0· 1%，KC1 0· 5%，FeS04 0· 001%，MgS04 0· 05%，蔗糖 3%，瓊脂 1. 5%，溶劑為去離子水，pH自然，121°C滅菌20分鐘。
[0021] 發酵培養：將斜面種子接種至1L液態發酵培養基，3(TC、20〇r/min條件下培養48 小時，培養液過濾，得到菌絲體80g濕重。液態發酵培養基終濃度組成為：葡萄糖20g/L，蛋 白胨 20g/L，蔗糖 10g/L，尿素 3g/L，NaCl5g/L，K2HP04 2g/L，MgS04lg/L，（NH4)2S04 5g/L， 溶劑為去離子水，pH自然，裝液量為500ml三角瓶裝液80ml，121°C滅菌20分鐘。
[0022] 將發酵培養得到的米曲霉WZ007濕菌體80g，浸泡在5ml磷酸緩沖液（pH值為7. 0) 中，-20~0°C冷凍干燥后獲得米曲霉WZ007凍干菌體20g。
[0023] 實施例2 :乙酯型魚油的制備
[0024] 乙酯型魚油（EPA和DHA總含量 60-70%，EPA質量含量 35-40%，DHA質量含量 25-30% )的制備：
[0025] 利用分子蒸餾和尿素包埋法對沙丁魚魚油（EPA質量含量21%，DHA質量含量 9% )進行富集。以EPA質量含量21%，DHA質量含量9%的沙丁魚魚油為原料，在POPE 2inchWFS分子蒸餾儀（美國POPE科學公司）進行分子蒸餾，蒸餾結束后，收集目標餾分， 再以質量比1:2加入尿素進行尿素包埋，制備得到EPA質量含量38%，DHA質量含量28% 的乙酯型魚油，其中分子蒸餾條件：蒸餾溫度90°C、預熱溫度40°C、內冷溫度15°C、刮膜器 轉速360r/min、進料速率2mL/min、真空度0.IPa的條件下對乙酯化魚油進行富集。尿素包 埋條件：尿素/乙酯化魚油的質量比2 :1，結晶溫度：TC，包埋時間18h。
[0026] 實施例3
[0027] 按實施例1方法制得的lg米曲霉WZ007凍干菌體，鍉魚魚油（EPA質量含量11%， DHA質量含量14% )和乙酯型魚油（實施例2方法制備，EPA質量含量38%，DHA質量含量 28 % )各5ml(甘油酯與乙酯摩爾比1:3)，70°C、200rpm條件下，水浴反應20h后，通過氣相 色譜儀監控乙酯型魚油中EPA和DHA總含量的變化，當EPA和DHA總含量穩定不變后，結束 反應，將反應液過濾，收集干菌體，濾液減壓蒸餾至無液體流出（50Pa，240°C)除去EPA\DHA乙酯，獲得的濃縮物為高含量EPA和DHA甘油酯型魚油，經檢測EPA和DHA總含量50. 2 %， 其中EPA含量29. 2%，DHA含量21. 0%。
[0028] 甘油酯魚油EPA和DHA含量檢測方法：
[0029] 取約10mg上述濃縮物于10mL離心管中，加入2mol/LNaOH-甲醇溶液lmL，充分