香菇C91-3菌株的Latcripin-9基因片段、編碼蛋白、制備方法及用圖
【專利說明】香薛C91-3菌株的因片段、編碼蛋白、制備方法及用途
技術領域
[0001]本發明涉及一種從香菇C91-3菌株中提取的因片段、編碼蛋白、制備方法及用途，所編碼的蛋白具有誘導腫瘤細胞凋亡、調節機體免疫力、調節細胞周期、抗腫瘤、清除自由基及染料廢水脫色等功能。
【背景技術】
[0002]真菌富含多種生物活性分子，包括核糖體失活蛋白、抗真菌蛋白、凝集素、泛素樣蛋白、多糖和激酶。其中的抗腫瘤成分以不良反應少、療效顯著等優點在腫瘤治療方面具有獨到之處。香菇菌C91-3屬真菌為擔子菌亞門擔子菌綱側耳科，該菌種已于2013年保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.7354。香菇菌C91-3含有健脾益氣，扶正祛邪，增強機體免疫力，防治癌癥等功效。[Zhao C，Sun H，Tong X，etal.An Antitumor lectin from edible Mushroom Agrocybe aegerita[J].B1chem J，2003，374:321-327]。香菇菌C91-3發酵液中含有多種蛋白成分，通過動物體內實驗證實有些蛋白成分具有較好的抗腫瘤作用[黃敏，寧安紅，張卓然等.香菇C91-3菌絲發酵液小鼠體內抗腫瘤作用的研究[J].中國微生態學雜志，1996，8 (3):38-40] ο體外實驗也證實，其發酵液中的一些蛋白組分具有誘導腫瘤細胞凋亡的能力[戴兵，黃敏，寧安紅.香菇C91-3菌絲發酵液蛋白抑制小鼠宮頸癌細胞株U14生長及誘導凋亡的實驗研究.浙江醫學，2004，26 (9) ；656 -658]。雖然目前已有關于從香菇C91-3菌中提取可誘導腫瘤細胞凋亡的基因片段、編碼蛋白及制備方法的相關報道，但是不同的基因片斷的作用效果不盡相同，亟待開發更多的表達蛋白藥效強、靶向性好、具備產業價值的香菇C91-3cDNA的基因片段。
【發明內容】
[0003]本發明是為了解決現有技術所存在的上述技術問題，提供一種從香菇C91-3菌株中提取的堪因片段、編碼蛋白及制備方法，所編碼的蛋白具有誘導腫瘤細胞凋亡、調節機體免疫力、調節細胞周期、抗腫瘤、清除自由基及染料廢水脫色等功能。
[0004]本發明的技術解決方案是:一種香燕C91-3菌株的Zaicri/jifl-SS因片段，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0005]—種如權利要求1所述香燕C91-3菌株的ZaicrijOi/7-SS因片段編碼蛋白，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0006]—種如權利要求1所述香燕C91-3菌株的ZaicrijOi/7-SS因片段的制備方法，其特征在于依次按如下步驟進行:
a.提取香菇C91-3菌株的菌絲體總RNA;
b.將菌絲體總RNA反轉錄合成cDNA ；
c.PCR擴增目標基因:
以所得到的cDNA為模板、以具有EcoR I和Xho I兩個酶切位點的PCR反應引物進行PCR反應；所述PCR反應引物序列如下:
上游引物EcoR I:
5’-TATCGGATCCGAATTCGTCTTTCTACTTGCATCAG-3’
下游引物Xho I:
5’-GGTGGTGGTGCTCGAGGTTTGCGTTATTCGCCCAG-3’ ；
d.回收純化DNA片段:
將所得到的PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，純化792bpMarker附近的明顯條帶，切膠回收DNA片段。
[0007]所述a步驟是取培養18天的香菇C91-3菌株的菌絲體，于研缽中加入液氮充分研磨，加入Trizol后室溫靜置30min，樣品融化后繼續研磨至裂解液透明狀，室溫靜置5min后，12000r/min離心5min，將上清轉移至另一離心管中，然后加入1/5體積氯仿，溫和振蕩后，4°C，12000 r/min離心，15 min ;吸取上層水相溶液并轉移至另一離心管中，加入等體積異丙醇，混勾后室溫靜置15 min，再次4°C，12000 r/min離心，10 min，棄上清，然后加入75%乙醇洗滌并干燥，最后用DEPC處理水溶解，得到香菇C91-3菌株的菌絲體總RNA。
[0008]所述c步驟的PCR反應體系50 μ?: cDNA模板1 μ?，上游引物0.5 μ?，下游引物0.5 μΙ,?ΝΤΡ Mixture 4 μ1、5Χ Prime STAR Buffer 10 μ1、2.5 U/μΙ 的 PrimeSTAR HS DNAPolymerase0.5 Μ.1、滅菌蒸飽水33.5 μ? ;反應條件:98°C變性 10 s，55°C復性 10 s，72°C延伸 1 min，30 個循環；72°C延伸 5 min ;4°C冷卻 10 min。
[0009]—種上述香燕C91-3菌株的Zaicri/jifl-SS因片段編碼蛋白在制備抗腫瘤、抗氧化或抗衰老藥物中的應用。
[0010]一種上述香菇C91-3菌株的因片段編碼蛋白在染料廢水脫色中的應用。
[0011]本發明是從香菇C91-3菌絲體轉錄組中，克隆出一段特異性基因片段，命名為
因片段，該基因片段所編碼的蛋白具有誘導腫瘤細胞凋亡、調節機體免疫力、調節細胞周期、抗腫瘤、清除自由基及染料廢水脫色等功能。可將該基因片段進行基因重組，并于pET_32a原核表達體系中進行高效表達，將表達產物通過親和層析進行分離和提純，獲得該基因編碼的蛋白質，該蛋白可用于研究細胞凋亡中的機制及其在細胞信號通路中的作用，也可用于制備治療腫瘤、抗氧化或抗衰老藥物，增加藥物種類。同時亦可應用于處理紡織工業的染料廢水脫色，無二次污染、利于環保。
【附圖說明】
[0012]圖1是本發明實施例PCR產物的1%瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0013]圖2是本發明實施例所用載體pET_32a (+)雙酶切后的電泳圖。
[0014]圖3是本發明實施例提取的因片段轉化后的單克隆陽性菌落。
[0015]圖4是本發明實施例重組表達蛋白的SDS-PAGE電泳圖。
[0016]圖5是本發明實施例誘導表達蛋白的Western-blot電泳圖。
[0017]圖6是本發明實施例純化后的目標蛋白SDS-PAGE電泳圖。
[0018]圖7是本發明實施例純化后的目標蛋白對Hela細胞的生長抑制率。
[0019]圖8是本發明實施例純化后的目標蛋白對Hep-2細胞的生長抑制率。
[0020]圖9是本發明實施例純化后的目標蛋白的清除氧自由基率不意圖。
[0021]圖10是本發明實施例純化后的目標蛋白對剛果紅染料脫色效果示意圖。
[0022]圖11是本發明實施例純化后的目標蛋白對活性艷藍染料脫色效果示意圖。
[0023]香菇C91-3菌株保藏日期:2013年3月15日；
分類命名??香叛 Q Lent inula edodes)；
保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)；
保藏單位地址:北京市朝陽區北辰西路1號院3號保藏號:CGMCC N0.7354。
【具體實施方式】
[0024]a.提取香菇C91-3菌株的菌絲體總RNA:
取用培養基培養18天的香菇C91-3菌株的菌絲體，于研缽中加入液氮充分研磨，加入lml的Trizol后室溫靜置30min，樣品融化后繼續研磨至裂解液透明狀，室溫靜置5min后，12000r/min離心5min，將上清轉移至另一離心管中，然后加入然后加入0.2 ml氯仿，溫和振蕩后，4°C，12000 r/min離心，15 min ;吸取上層水相溶液0.5 ml并轉移至另一干凈的1.5 ml離心管，加入等體積異丙醇，顛倒混勾后室溫靜置15 min，再次4°C, 12000 r/min離心，10 min,棄上清，然后加入75%乙醇1 ml洗滌并干燥，最后用DEPC處理水溶解，香菇C91-3菌株的菌絲體總RNA ；
紫外分光光度計驗證純度，0D260/280比值在1.8-2.0之間。
[0025]進行1%瓊脂糖凝膠電泳驗證，表明RNA提取純度較高。
[0026]b.將菌絲體總RNA反轉錄合成cDNA ；
使用TaKaRa 3' -Full RACE Core Set Ver.2.0試劑盒反轉錄合成cDNA，本試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司。
[0027]反應體系:香菇菌絲體總RNA (Ιμδ/μ1) 1 μ1、3’ RACE Adaptor (5 μΜ) 1 μ?、dNTP Mixture (10 mM each) 1 Kl、RNase Free dH20 4.5 μ? ；
反應條件:70°C，10 min立即冰上放置2分鐘；
然后加入下列組分:5X M-MLV Buffer 2μ1、RNase Inhibitor (40 U/μΙ) 0.25 μ?、Reverse Transcriptase M-MLV (無RNA酶)(200 U/μΙ) 0.25 Μ.1，體系總體積達到 10 μ?。
[0028]反應條件:42°C，60 min 70°C，15 min得到反轉錄反應液(cDNA)。
[0029]c.PCR擴增目標基因:
以所得到的cDNA為模板、以具有EcoR I和Xho I兩個酶切位點的PCR反應引物進行PCR反應；所述PCR反應引物序列如下:
上游引物EcoR I:
5’-TATCGGATCCGAATTCGTCTTTCTACTTGCATCAG-3’
下游引物Xho I:
5’-GGTGGTGGTGCTCGAGGTTTGCGTTATTCGCCCAG-3’ ；
引物委托寶生物(大連)公司合成。
[0030]PCR反應體系50 μ?: cDNA模板1 μ?，上游引物0.5 μ?，下游引物0.5 μ?，dNTPMixture (各 2.5 mM) 4 μΚ5XPrimeSTAR Buffer (Mg2+ plus) 10 μ?、PrimeSTAR HS DNAPolymerase (2.5 υ/μ1)0.5 Μ.1、滅菌蒸飽水 33.5 μ? ;反應條件:98°C變性 10 s，55°C復性10 s，72°C延伸 1 min, 30 個循環；72°C延伸 5 min ;4°C冷卻 10 min。
[0031]PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳如圖1所示，圖1中Μ: DL2, 000 DNA Marker ；1:
目的克隆片段產物，證明成功獲得了該基因片段。
[0032]d.回收純化DNA片段:
將所得到的PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，純化792bpMarker附近的明顯條帶，切膠回收DNA片段，命名為堪因片段。
[0033]實驗:
1.因片段序列測定:
測序由大連寶生物公司測定，香菇C91-3因片段核苷酸序列如SEQ ID
N0.1。Latcripin-9的基因片段序列長為792bp的cDNA，其含有264個密碼子可讀框(0RF)。經使用NCBI數據庫核苷酸相似性檢索表明，無任何相似性的基因片段序列，證明此基因為一新型基因片段。
[0034]2.因片段的克隆表達
2.1載體構建
2.1.1將質粒pET_32a (+)，使用EcoR I /Xho I進行酶切；
反應體系(37°(:過夜): pET-32a (+) (100 ng/μ?) 10 μ? 10 XK Buffer5 μ?
EcoR I (10 U/μΙ)1 μ?
Xho I (10 U/μΙ)1 μ?
dH20 Up to50 μ?
取5 μι進行1%瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖2所示，Μ: λ -Hind III digest ；1:pET-32a (+)- EcoR I /Xho I ；2:pET_32a (+)_plasmid