仿刺參凝集素基因、重組融合蛋白及制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于海洋生物基因工程領域，尤其涉及一種仿刺參凝集素基因、重組融合蛋白及制備方法。
【背景技術】
[0002]海參屬棘皮動物們海參綱，約有1200多種，分布在我國海域的有140多種，其中品質最佳、藥用價值最高的是產于中國遼寧、山東、河北等地的北太平洋沿海仿刺參(Apostichopus japonicus)0近些年來，海參已經成為東亞和東南亞地區重要的生態經濟物種，在中國北部沿海地區海參養殖業也迅速發展起來。然而，由于海洋中含有高濃度病原菌導致海參養殖嚴重的病害問題，制約了海參養殖業的健康發展。通過提高海參天然免疫力來抵抗外來病原體的侵害是海參健康養殖最科學有效的途徑。
[0003]海參的免疫系統中存在多種免疫因子，包括凝集素、抗菌肽、溶菌酶、模式識別受體和補體C3等，目前對于凝集素(Lectin)的研究最為廣泛、透徹。凝集素是一類非免疫起源、非酶的、可促使細胞凝集的蛋白質或多價糖結合蛋白，其分子中含有一個或多個可與單糖或寡糖特異可逆結合的非催化的結構域，具有對糖、糖脂、糖蛋白高度親和并專一結合的特性。凝集素具有識別細胞表面特異性糖結構的功能，并參與細胞凋亡、細胞粘附、促有絲分裂、跨膜信號轉導和識別腫瘤細胞等生命活動。孫永欣等報道，海參體液中的凝集素具有修復傷口的作用；通過與外源細胞上的特異性糖結構相結合發揮凝集和調理殺傷作用。Cheung等研究表明，海洋物種中分離出來的凝集素具有高效的抗細菌、抗真菌、抗病毒、消炎、抗寄生物和抗癌變等多種活性，可見凝集素在海洋無脊椎動物的先天免疫中具有重要作用。然而，分離提取天然海參凝集素過程復雜、成本高，迄今為止還沒有關于重組仿刺參凝集素基因、編碼蛋白及制備方法的相關報道。
【發明內容】
[0004]本發明是為了解決現有技術所存在的上述技術問題，提供一種仿刺參凝集素基因、重組融合蛋白及制備方法。
[0005]本發明的技術解決方案是:一種仿刺參凝集素基因，其特征在于核苷酸序列如SEQID NO:1 所示。
[0006]一種如權利要求1上述仿刺參凝集素基因的重組融合蛋白，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0007]—種上述仿刺參凝集素基因的制備方法，其特征在于依次按如下步驟進行:
a.提取仿刺參總RNA;
b.將仿刺參總RNA 反轉錄合成 3’ -RACE-Ready cDNA 和 5’ -RACE-Ready cDNA ；
c.以3’-RACE-Ready cDNA為模板，用特異性引物Ajmbcl_3和UPM進行PCR反應，得到3’ -First round PCR產物，所述特異性引物Ajmbcl_3序列如下:
Ajmbcl-3:5’ GGACTGGCTTCAATGGAAAGTGTTA 3’ ； d.以3’-Firstround PCR產物為模板，用特異性引物Ajmbcl_n3和NUP進行PCR反應，得到3’ -ΝΕΤ-PCR產物，所述特異性引物Ajmbcl-n3序列如下:
Ajmbcl-n3:5’ ACAGTCGCGGGGCCATAGCATCGGG 3’ ；
e.以5’-RACE-Ready cDNA為模板，用特異性引物Ajmbcl_5和UPM進行PCR反應，得到5’ -First round PCR產物，所述特異性引物Ajmbcl_5序列如下:
Ajmbcl-5:5’ GATGTACACCTGTGGATCCCAACCG 3’ ；
f.以5’-Firstround PCR產物為模板，用特異性引物Ajmbcl_n5和NUP進行PCR反應，得到5’ -ΝΕΤ-PCR產物，所述特異性引物Ajmbcl-n5序列如下:
Ajmbcl-n5:5’ ATGACCACTGGCAAGAACATTACCT 3’ ；
g.將3’-ΝΕΤ-PCR產物和5’ -ΝΕΤ-PCR產物拼接得到完整凝集素基因片斷。
[0008]本發明以所得到的完整凝集素基因片斷為模板，用RT-PCR引物擴增出完整的凝集素基因片段，并將其連接到PMD19-T載體上，所得陽性克隆表達、純化，即得到仿刺參凝集素重組融合蛋白rAj-MBCL。制備方法簡單、純化率高，所獲得的仿刺參凝集素重組融合蛋白rAj-MBCL成本低、凝集活性高、表達量多、實驗重復差異小、結果穩定、可控性強，可用于海參免疫增強劑的工業化開發，可以有效抑制海參病害問題，減少污染，建立健康的養殖環境。
【附圖說明】
[0009]圖1本發明實施例仿刺參凝集素目的基因的瓊脂糖凝膠電泳檢測圖。
[0010]圖2本發明實施例重組表達質粒的雙酶切電泳鑒定圖。
[0011]圖3本發明實施例重組表達體系(pET32a-AjMBCL)表達產物的SDS-PAGE凝膠電泳及Western blot鑒定結果示意圖。
[0012]圖4本發明實施例仿刺參凝集素重組融合蛋白rAj-MBCL凝血活性分析結果示意圖。
【具體實施方式】
[0013]a.提取仿刺參總RNA:
取仿刺參體壁lOOmg，用液氮研磨，加入lmlTRNzol -A+提取試劑(TIANGEN)，其余具體操作根據TIANGEN公司的TRNzol-A+總RNA提取試劑說明書進。
[0014]b.將仿刺參總 RNA 反轉錄合成 3’ -RACE-Ready cDNA 和 5’ -RACE-Ready cDNA。
[0015]c.以3’-RACE-Ready cDNA為模板，用特異性引物Ajmbcl-3和UPM進行PCR反應，得到3’ -First round PCR產物，所述特異性引物Ajmbcl-3序列如下:
Ajmbcl-3:5’ GGACTGGCTTCAATGGAAAGTGTTA 3’ 。
[0016]d.以3’ -First round PCR產物為模板，用特異性引物Ajmbcl_n3和NUP進行PCR反應，得到3’ -ΝΕΤ-PCR產物，所述特異性引物Ajmbcl-n3序列如下:
Ajmbcl-n3:5’ ACAGTCGCGGGGCCATAGCATCGGG 3’ ；
3’端核苷酸序列的獲得:將3’ -ΝΕΤ-PCR擴增產物用EasyPure Quick GelExtract1n Kit純化后與pMD19_T載體連接，送生物生工測序，獲得仿刺參凝集素Aj-MBCL基因的3’端序列。
[0017]e.以 5’ -RACE-Ready cDNA 為模板，用特異性引物 Ajmbcl-5 和 UPM 進行 PCR 反應，得到5’ -First round PCR產物，所述特異性引物Ajmbcl-5序列如下: Ajmbcl-5:5’ GATGTACACCTGTGGATCCCAACCG 3’ ；
f.以5’-First round PCR產物為模板，用特異性引物Ajmbcl_n5和NUP進行PCR反應，得到5’ -ΝΕΤ-PCR產物，所述特異性引物Ajmbcl-n5序列如下:
Ajmbcl-n5:5’ ATGACCACTGGCAAGAACATTACCT 3’ ；
5’端核苷酸序列的獲得:將5’-NET_PCR擴增產物用EasyPure Quick Gel Extract1nKit純化后與pMD19-T載體連接，送生物生工測序，獲得仿刺參凝集素Aj-MBCL基因的5’端序列。
[0018]g.將3’ -ΝΕΤ-PCR產物和5’ -ΝΕΤ-PCR產物拼接得到完整凝集素基因片斷:
將3’-RACE獲得的刺參凝集素Aj-MBCL基因的3’端序列及5’-RACE獲得的仿刺參凝集素Aj-MBCL基因的5’端序列用Seqman軟件進行拼接，得到完整的仿刺參凝集素Aj-MBCL基因核苷酸序列。經測序，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，含有的完整0RF，長為537bp。
[0019]一.基因擴增、克隆與重組質粒的構建:
1.以完整的凝集素基因片段為模板，用RT-PCR引物進行選擇性擴增，所述RT-PCR引物如下:
mAjmbcF:5’ CCGGAATTCTGTACTTTGACGGCTTGTC 3’ EcoR ImAjmbcR:5’ CCCAAGCTTATTAAATTGATACACGGTG 3’ Hind III ；
將RT-PCR產物經過凝膠電泳檢測后用EasyPure Quick Gel Extract1n Kit進行回收、純化。瓊脂糖凝膠電泳分析圖如圖1所示:圖1中M:Marker (由上至下依次為2000，1000，750，500，250，100bp) ；1: Aj-MBCL 基因 PCR 擴增片段，477bp。
[0020]2.再用EcoR I和Hind III對純化的RT-PCR產物及表達載體pET_32a ( + )進行雙酶切，電泳回收目的條帶，用T4 ligase (TaKaRa)連接，轉化BL21 (DE3)感受態細胞，涂布LB (AMP+)瓊脂平板，PCR鑒定陽性克隆。PCR鑒定正確者即為基因工程表達菌株，酶切電泳鑒定如圖2所示。
[0021]圖 2 中 M -Marker (由上至下依次為 8000，5000，3000，1500，1000，500bp)；
1:重組表達質粒(pET32a-Aj-MBCL) ；2:重組表達質粒(pET32a_Aj-MBCL)經雙酶切。
[0022]以上PCR 反應用 buffer、dNTP 和酶由 TaKaRa LA