一種NT-proBNP核酸適配體及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于NT-proBNP檢測技術領域，特別涉及一種NT-proBNP核酸適配體及其 應用。
【背景技術】
[0002] 腦鈉肽（BNP)最早由Sudoh等在豬腦中發現，是一種由32氨基酸肽鏈組成的多肽 類神經激素。人類心臟初始分泌的BNP是一種由132個氨基酸組成的前體，其后被酶切降 解為具有生物活性的BNP(32個氨基酸殘基組成）及腦鈉肽前體N末端（NT-ProBNP，76個 氨基酸殘基組成）。BNP和NT-ProBNP主要由心肌壁受壓后心室應答釋放，是對心功能敏感 且特異的標志物，其在血液中的濃度與心功能障礙的嚴重程度相關，可以用來更客觀的評 價患者疾病的嚴重程度和患者的預后。廣泛應用于心衰診斷、心衰預后與監視的評估、急性 冠脈綜合癥的危險分類、早期或輕度的心功能不全等。
[0003] NT-ProBNP較BNP在評價心功能上更具有優勢，其優勢在于：l、NT-proBNP由76個 氨基酸組成，較BNP半衰期長，其半衰期大于lh，在血液中清除較慢，可累積較高濃度，更能 靈敏地反映心功能的狀態和變化，尤其是在早期診斷中；標本可以存放，即可以中心實驗室 檢測，也可以床邊檢測，BNP只能床邊即刻檢測；2、由于無生理活性，因而不受治療用合成 BNP的干擾；3、NT-proBNP可以使用血清和血漿，抗干擾性強，BNP只能使用血漿標本。4、 NT-proBNP的定量結果能提供可靠，且具有良好的重復性臨床信息，更適合臨床應用。因此， 目前臨床應用中已逐漸呈現將NT-proBNP取代BNP的趨勢。
[0004] 目前NT-proBNP檢測方法主要為免疫檢測方法，一種為競爭酶聯免疫分析，如 Biomedica Gruppe公司的產品；一種為雙抗體夾心法，如Roche Diagnostics的雙抗體夾 心化學發光法，已申報發明專利。目前，基于抗體的方法，有一定優勢，但也有一些固有的缺 陷。現在，科學家不約而同的把注意力聚焦到分子生物學新技術在生物檢測的應用上。
[0005]SELEX技術（系統進化指數富集技術）是90年代初研制的一種新的組合化學技 術。其基本原理就是利用分子生物學技術，構建人工合成的單鏈隨機寡核苷酸文庫，其中隨 機序列一般長度在20-40bp左右，文庫容量在1014-1015之間。由于單鏈隨機寡核苷酸片段 特別是RNA易形成發卡、口袋、假節、G-四聯體等二級結構，故能與蛋白質、小肽，甚至金屬 離子結合，形成具有很強結合力的復合物。這種方法具有簡便、快速、經濟等特點，與其他組 合化學庫如隨機肽庫、抗體庫和噬菌體表面展示文庫相比，從寡核苷酸文庫中篩選出的核 酸適體具有許多優勢：a.本身是寡核苷酸，分子量較小可以化學合成，節約成本；b.具有比 抗體更高的特異性和相近的親和性；c.便于標記，在不同部位有選擇性的標記；d.穩定性 好，重復性好，易于保存，對高溫和劇烈條件不敏感。因此，寡核苷酸適配體在臨床檢測及診 斷中具有良好的應用前景。有關核酸適配體檢測新技術已廣泛應用生物檢測、生物傳感、體 內成像、蛋白核酸功能研究各個領域，顯示出了誘人的前景。
[0006] NT-proBNP為76氨基酸殘基的多肽，分子量小，可利用的抗原表位局限，且被羅氏 專利保護，核酸適配體分子量只有10-20KD，較抗體IgG150kD小得多，在建立夾心法的檢測 中，可以獲得多個抗原位點的特異核酸適配體，可以克服抗體分子量大而引起空間位阻的 影響，易于夾心檢測方法的建立。
【發明內容】
[0007] 本發明針對現有技術中的不足，其目的在于提供一種NT-proBNP核酸適配體及其 應用。
[0008] 為了實現上述目的，本發明采取的技術方案如下；
[0009] 一種NT-proBNP核酸適配體，所述的核酸適配體為SEQ ID : 1-15所示的核苷酸序 列中的任意一條。
[0010] 所述的核酸適配體能與NT-proBNP蛋白或NT-proBNP蛋白N端氨基酸序列制備的 單克隆抗體相結合。
[0011]所述的NT-proBNP蛋白N端的氨基酸序列為GlySerAlaSerAspLeuGluThr SerGlyLeuGlnGluGlnArg。
[0012] 一種NT-proBNP核酸適配體在制備NT-proBNP檢測試劑盒中的應用。
[0013] 所述的NT-proBNP核酸適配體被生物素標記。
[0014] 一種NT-proBNP核酸適配體在制備NT-proBNP檢測試紙條中的應用。
[0015] 所述的NT-proBNP核酸適配體被膠體金標記。
[0016] 所述的NT-proBNP檢測試紙條的組成為：在PVC背襯（1)上依次粘附有樣品墊 (2)、結合墊（3)、硝酸纖維素膜（4)和吸水墊（5);所述的結合墊（3)上包被有由膠體金標 記的NT-proBNP核酸適配體；所述的硝酸纖維素膜設置有檢測線（6)和質控線（7);其中， 檢測線（6)上包被有NT-proBNP蛋白N端氨基酸的單克隆抗體，質控線（7)上包被有與膠 體金標記的NT-proBNP的核酸適配體結合的試劑。
[0017] 所述的與膠體金標記的NT-proBNP的核酸適配體結合的試劑為NT-proBNP核酸適 配體的互補序列。
[0018] 本發明的優點為：所述的NT-proBNP核酸適配體本身是寡核苷酸，分子量較小， 可以化學合成，節約成本，具有比抗體更高的親和性和特異性；同時所述的NT-proBNP核 酸適配體便于標記，重復性和穩定性好，易于保存。用所述NT-proBNP核酸適配體制備的 NT-proBNP檢測試劑盒和試紙條對NT-proBNP檢測靈敏，且易于優化。
【附圖說明】
[0019] 圖1為合成的NT-proBNP基因與proBNP基因序列的測序比對圖。
[0020] 圖2為pGEX4T-1-NT-ProBNP表達載體的雙酶切電泳圖。
[0021] 圖3為純化后的GST-NT-proBNP蛋白的SDS-PAGE電泳圖；其中，1 :誘導前全菌，2 : 誘導沉淀，3 :誘導上清，4 :GST柱純化穿透液，5-9 :GST純化洗脫收集液，10 :蛋白分子量標 準。
[0022] 圖4為純化后的12G4單克隆抗體的SDS-PAGE電泳圖。
[0023] 圖5為陽性克隆PCR鑒定電泳圖。
[0024] 圖6為NT-proBNP核酸適配體活性評價柱形圖。
[0025] 圖7為一種NT-proBNP檢測試紙條的結構示意圖。
【具體實施方式】
[0026] 下面結合附圖和具體實施例對本發明做進一步說明。
[0027] 實施例1 :全基因合成NT-proBNP基因，構建pGEX4T-l-NT-ProBNP表達載體并純 化GST-NT-proBNP蛋白。
[0028] (1)通過genebank查詢proBNP基因序列，根據成熟BNP后剪切的N端序列即 NT-proBNP序列設計全序列合成方案，通過DNAwork2. 0軟件進行密碼子優化，不改變氨基 酸序列組成，并使蛋白更易于在原核大腸桿菌中表達，然后在優化后的核酸序列的兩端加 上EcoRI和SalI酶切位點，便于與表達載體連接克隆，優化設計后的核苷酸序列如SEQ ID:16所示。將優化后的序列送交金斯瑞公司進行合成，圖1為合成的NT-proBNP基因與 proBNP基因序列的測序比對圖。
[0029] (2)將合成基因NT-proBNP從PUC57載體中雙酶切后膠回收，并將pGex4T-l 載體雙酶切，回收載體片段，將回收基因片段和載體片段經T4DNA連接酶連接，構建成 pGEX4T-l-NT-Pr〇BNP表達載體，并轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞中，涂平板，37度培養 16h，挑取單克隆進行液體培養并提取質粒進行雙酶切鑒定。圖2為pGEX4T-l-NT-Pr〇BNP 表達載體的雙酶切電泳圖，從圖可知表達載體構建成功。
[0030] (3)將構建好的pGEX4T-1-NT-ProBNP表達載體轉化至大腸桿菌BL21 (DE3)感受態 細胞中，挑取單克隆進行IPTG誘導表達，挑選表達量高的單克隆保存作為菌種。放大菌種 培養，進行誘導后收集菌體，超聲破碎，采用GST標簽親和柱進行親和純化，收集洗脫峰進 行SDS-PAGE電泳分析，如圖3所示。純化的GST-NT-proBNP蛋白純度達95%以上，可以滿 足接下來的實驗需求。
[0031] 實施例2 :制備NT-proBNP蛋白N端氨基酸的單克隆抗體。
[0032] 分析NT-proBNP蛋白的抗原表位，選擇N端優勢抗原表位，人共合成NT-proBNP蛋 白的N端 15 個氨基酸多肽(GlySerAlaSerAspLeuGluThrSerGlyLeuGlnGluGlnArg)，將合成 的多肽與牛血清白蛋白（BSA)共價偶聯后進行免疫，當血清效價達到要求后，進行脾細胞 分離，并與SP/20骨髓瘤細胞融合，進行單細胞克隆，將抗體效價高的單細胞克隆進行亞克 隆，如表1所示：5G4、5E7和12G4單克隆抗體活性較高，將此3株活性較高的單克隆抗體制 備腹水，并用proteinA親和層析進行純化。圖4為純化后的12G4單克隆抗體的SDS-PAGE 電泳圖，顯示為重鏈、輕鏈兩條帶。
[0033] 表1 :單克隆抗體的篩選（0D450nm吸光度）
[0034]
[0035] 實施例3:篩選與獲得的單克隆抗體配對的NT-proBNP核酸適配體。
[0036] 篩選步驟如下：
[0037] 1、硅包磁珠經APTES(2% )氨基硅烷化處理，使其帶活性氨基，形成氨基磁珠；
[0038]2、將 8ug/ml的NT-proBNP單克隆抗體（5G4)，在 37°C下經EDC/NHS(4mg/ml/llmg/ ml)活化羧基，活化時間為15min;然后取lml活化后的單克隆抗體與lmg氨基磁珠在37°C 下偶聯lh，形成偶聯抗體磁珠；
[0039] 3、用PBS清洗偶聯抗體磁珠5次，然后用1 %BSA封閉過夜；
[0040] 4、加入100ul(2mg/ml)的GST-NT-proBNP蛋白到lml的偶聯抗體磁珠中，孵育2h， 形成結合GST-NT-proBNP蛋白的偶聯抗體磁珠；
[0041] 5、用SHMCK(0. 2%Tween-20)洗 5 次；
[0042] 6、將人工合成的ssDNA文