一種優化制備滅活疫苗和/或減毒活疫苗的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及全病毒疫苗制備領域，具體地說，涉及一種優化制備滅活疫苗和/或 減毒活疫苗的方法。
【背景技術】
[0002] 全病毒疫苗（包括弱毒苗與滅活苗）在現代疫苗應用中依舊占據相當大的比重。 全病毒疫苗又被稱為常規疫苗，包括滅活疫苗與減毒活疫苗，其中減毒活疫苗是采用人工 定向變異的方法，或從自然界篩選出毒力高度減弱或基本無毒的活的微生物制成的疫苗。 減毒活疫苗接種后，在機體內有一定的生長繁殖能力，免疫效果強而持久，一般只需接種一 次,免疫能力會終生保持，除刺激機體產生細胞免疫和體液免疫外，尚能產生局部免疫保 護。按照這一標準，最好的疫苗無疑就是活的、減毒的病原體，然而散毒威脅是其始終無法 回避的問題。滅活疫苗是選用免疫原性強的病原微生物經培養，用物理或化學方法將其滅 活后，再經純化制成。滅活疫苗已失去對機體的感染力，但仍保持其免疫原性，可以刺激機 體產生相應的免疫力，抵抗野毒株的感染。滅活疫苗常需多次接種，接種一次不產生具有保 護作用的免疫，僅僅是"初始化"免疫系統。非全病毒疫苗可最大限度地降低毒力逆轉的風 險，其中亞單位疫苗是在大分子抗原攜帶的多種特異性的抗原決定簇中，只有少量抗原部 位對保護性免疫應答起重要作用。通過化學分解等蛋白質水解方法使天然蛋白質分離，提 取病毒特殊區域，篩選出具有免疫活性的片段制成的疫苗。亞單位疫苗能消除許多無關抗 原誘發的抗體，從而減少疫苗的副反應和疫苗引起的相關疾病。基因工程疫苗是指利用DNA 重組生物技術，將病原體外殼蛋白質中能誘發機體免疫應答的天然或人工合成的遺傳物質 定向插入細菌、酵母或哺乳動物細胞中，使之充分表達，經純化后而制得的疫苗。但是這兩 類疫苗的不足之處是免疫原性較低，且不全面，需與佐劑合用才能產生好的免疫效果，因此 往往達不到最佳的保護效果。
[0003] 目前全病毒疫苗制備領域面臨的難題是，很多疫苗生產用毒株效價不高，這直接 影響著疫苗的效果。國內外一些課題組將苗毒在不同的保存條件下，發現效價滴度呈現一 定規律的變化，并最終確定合適的保存條件。還有一些課題組采用免疫佐劑提高疫苗效用， 如無機佐劑（氫氧化鋁等）、有機佐劑（細菌產物等）、合成佐劑（左旋咪唑等）、油劑（費 氏佐劑等），以及環孢素A、雷帕霉素等免疫抑制劑。然而，國家正式審批的佐劑類型非常有 限，也不提倡用于人體，這些佐劑主要用于動物實驗，而動物多次注射后常會發生佐劑病， 因此佐劑的使用要求非常謹慎，也受到極大限制。此外，另一些課題組對生產用毒株進行毒 株表型或遺傳學改造，使其更適合于弱毒苗或滅活苗的開發。還有研究者嘗試不同細胞系， 如將貼壁細胞改換成懸浮細胞，以通過增加單位體積的細胞密度，提升細胞增殖病毒的效 價滴度。上述方案一定程度地提高了疫苗毒的效價滴度，但并沒有通過深入了解病毒復制 的宿主細胞因素，發現并開發有利于病毒復制的細胞內資源。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種優化制備滅活疫苗和/或減毒活疫苗的方法。
[0005] 為了實現本發明目的，本發明提供膠質瘤抑癌候選基因2(Gliomatumor suppressorcandidateregiongene2,GLTSCR2)編碼蛋白P60 在制備滅活疫苗和 / 或減 毒活疫苗中的應用，所述膠質瘤抑癌候選基因2編碼蛋白的氨基酸序列如SeqIDNo. 1所 示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0006]P60蛋白是一種定位于細胞核仁的核糖體蛋白P60,其可提高4科類病毒效價1-3 個lg單位，包括冠狀病毒（如傳染性支氣管炎病毒）、副粘病毒（如犬瘟熱與新城疫病毒）、 正粘病毒（如流感病毒）、及皰瘆病毒（如單純皰瘆病毒與馬立克病毒）。分子質量為60kDa 的P60蛋白與細胞周期調節、DNA損傷應答及細胞凋亡關系十分密切。據報道，在DNA損傷 情況下，核仁蛋白P60可定位至細胞核質，并與重要的腫瘤抑制因子P53結合，穩定P53的 同時抑制細胞生長；另一方面，為了應對核仁應激，P60蛋白可阻斷核糖體蛋白與MDM2結 合，從而促進P53泛素化降解。此外，PI3K-Akt/PKB信號途徑在細胞存活與病毒致病等方 面都起到重要作用，PTEN是該通路的主要剎車蛋白，但P60基因敲除后PTEN會迅速降解， 并導致腫瘤發生。因此在腫瘤學領域，P60擁有"腫瘤抑制因子"及"抑制癌癥的路障"雙重 身份。P60獨特的生化特性與復雜功能使之迅速成為科研熱點，但是在病毒學領域，鮮見文 獻報道。
[0007] 本發明首次發現，P60蛋白可通過幾種細胞途徑發揮功能，如調控先天免疫系統、 細胞防御系統、蛋白合成系統。
[0008] 本發明提供一種優化的制備滅活疫苗和/或減毒活疫苗的方法，在宿主細胞中過 表達膠質瘤抑癌候選基因2,并用滅活疫苗和/或減毒活疫苗生產用毒株接種宿主細胞，培 養細胞，收獲病毒液。
[0009] 所述滅活疫苗和/或減毒活疫苗包括但不限于冠狀病毒科（如傳染性支氣管炎病 毒）、副粘病毒科（如犬瘟熱與新城疫病毒）、正粘病毒科（如流感病毒）及皰疹病毒科（如 單純皰疹病毒和馬立克病毒）等的滅活疫苗和/或減毒活疫苗。
[0010] 前述的方法，待宿主細胞的匯合度達到80~90%時，按1~10個TCID5。接種滅 活疫苗和/或減毒活疫苗生產用毒株。
[0011] 本發明中采用的細胞培養方式為貼壁培養或懸浮培養。
[0012] 本發明還提供一種過表達膠質瘤抑癌候選基因2的宿主細胞。
[0013] 本發明還提供上述宿主細胞在制備滅活疫苗和/或減毒活疫苗中的應用。
[0014] 本發明通過在宿主細胞內過表達編碼P60蛋白的基因，優化用于制備滅活疫苗和 /或減毒活疫苗的宿主細胞內復制環境，提高4科類病毒（包括冠狀病毒科、副粘病毒科、正 粘病毒科及皰疹病毒科）效價1-3個lg單位，本發明為優化全病毒疫苗的病毒滴度提供了 新策略與可行依據，在生物醫學領域具有重要的應用前景和創新意義。
【附圖說明】
[0015] 圖1為p60在病毒感染宿主細胞中的特性與功能；其中，A1，兩種細胞的蛋白p60 在未感染時的細胞定位，可見位于細胞核中；A2,在人單純皰疹病毒-l(HSV-l)感染后，可 見P60遷移至細胞質；A3,在新城疫病毒（NDV)感染后，可見p60遷移至細胞質；B，HSV-1 感染（10TCID5。)Η印-2不同時間后，收集細胞樣品進行細胞核-質分離，再采用各抗體進行 western-blot分析，可見p60與其伴侶蛋白PTEN均出現先入核后出核的定位變化趨勢；C, 在病毒感染同時加入DNA合成抑制劑PMEG(+)，不同時間后（實驗條件與A與B相同），可 見PMEG(10μM)不會影響p60總表達水平，但是會顯著影響細胞定位，推測p60出核與病毒 復制直接相關；D，將PTEN敲除96h后（800ng)，過表達GFP-N1或GFP-p60 (10μg)，40h后 感染HSV-1不同時間，可見PTEN的敲除沒有抑制過表達p60對病毒復制的增進作用，因此 P60發揮功能與PTEN并不完全相關。
[0016] 圖2為實施例中過表達或敲除p60基因對2種病毒復制的影響；其中，A1，從左至 右依次為，Hep-2細胞過表達對照GFP-N1質粒后感染NDV、過表達GFP-p60質粒后感染NDV、 只感染NDV、H印-2細胞敲除對照scramble基因后（Neg)感染NDV、敲除對照p60基因后感 染NDV，所用質粒10μg，過表達時間為40小時（A2同）；敲除siRNA用量為800ng，時間為96 小時（A2同）；感染時間為48小時，10個TCID5Q(A2同），而后采用細胞病變法測病毒滴度； A2,從左至右依次為，除了p60樣品重復1次（標號2-3)，其他樣品處理方法與A1同，所用 病毒蛋白NP抗體，1:1000稀釋。可見p60敲除不利于NDV復制，而過表達則可優化病毒復 制；B1，從左至右依次為，Η印-2細胞過表達對照GFP-N1質粒后感染HSV-1、過表達GFP-p60 質粒后感染、只感染HSV-1、細胞敲除對照scramb1e基因后感染、敲除對照ρ60基因后感染， 所用質粒10μg，過表達時間為40小時（Β2同）；敲除siRNA為800ng，時間為96小時（圖 B2同）；感染時間為48小時，10個TCID5Q(B2同），然后采用細胞病變法測病毒滴度；B2,從 左