一種紅豆杉根際多環芳烴降解菌的篩選方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物技術領域，涉及一種紅豆杉根際多環芳烴降解菌的篩選方法及 應用。
【背景技術】
[0002] 多環芳烴（PAHs)是一類分子中含有兩個以上苯環的有機化合物。這類物質化學 性質穩定，毒副作用大，易對人類造成致畸性、致癌性和致突變性等危害。環境中多環芳烴 的沉積主要來源于煤和石油的燃燒，工業生產、垃圾焚燒、汽車尾氣排放等也會造成PAHs 的大量增加。環境中PAHs數量多分布廣，難以集中治理，用物理和化學修復方法難以將它 們完全消除，還會對環境造成二次污染，生物修復技術能很好的解決上述問題。
[0003] 我國有多種紅豆杉屬植物，其次生代謝產物紫杉醇具有抗癌功效。對紅豆杉的藥 用價值研究很多。目前，紅豆杉屬植物內生菌種類及其次生代謝產物已成為研究熱點。南 方紅豆杉是我國特有物種，其內生真菌種類豐富多樣，李冬利等從南方紅豆杉的葉、枝條、 樹皮及果實中共分離到內生真菌55株，通過形態學和分子生物學鑒定，發現其中4株菌可 能為新種。宋培勇等從南方紅豆杉的莖、皮和葉分離出52株細菌，用分子生物學方法確定 其種屬。郝大程等用克隆測序方法首次揭示南方紅豆杉根際微生物多樣性，但至今對其功 能潛力所知甚少，從中分離出能降解多種PAHs的微生物具有重要的理論價值和工程實踐 意義，并有利于紅豆杉資源的可持續綜合利用。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于克服現有技術中存在的缺陷，提供一種紅豆杉根際多環芳烴降 解菌的篩選方法。該方法對紅豆杉根際真菌進行馴化，篩選出以芘為唯一碳源的三個菌株， 解決環境中多環芳烴的污染問題。操作簡便易行，可直接應用于生產實踐。
[0005] 其具體技術方案為：
[0006] 一種紅豆杉根際多環芳烴降解菌的篩選方法，包括以下步驟：
[0007] 取2ml100g/L活化根際土樣加入到48ml25mg/L芘溶液中，28°C振蕩培養5d;取 2ml富集液加入到48ml50mg/L芘溶液，28°C振蕩培養5d;循環往復，直到芘濃度為0. 2g/ L;經過形態觀察及rDNA-ITS序列分析鑒定出踝節菌屬（Talaromycesverruculosus，T)， 殘孔菌屬（Abortiporusbiennis，R)和尖抱鏡刀菌（Fusariumoxysporum，F)，踝節菌屬和 殘孔菌屬是用濃度為0. 2g/L芘馴化篩選出的優勢菌，尖孢鐮刀菌不能耐受高濃度芘，只能 在含50mg/L芘的平板上生長。將純化的踝節菌屬接入裝有50mL發酵培養基的250mL搖瓶 中，在30°C、150r/min的搖床中培養2d;取發酵液測絮凝率，經多次連續傳代，踝節菌屬的 絮凝率均達到90%。
[0008] 進一步，所述踝節菌屬（簡稱T)于2014年11月2日保藏于中國典型培養物保藏 中心，菌種保藏號為CCTCCNo:M2014542。
[0009] 本發明所述踝節菌屬在去除環境中PAHs污染物過程中的應用。
[0010] 本發明的有益效果是：
[0011] 本發明不僅修復成本低、無二次污染，還可以大面積的應用到環境治理中，是去除 環境中PAHs等污染物的重要而有效的途徑。 保藏信息 踝節菌屬DJTU_SJ5(TalaromycesdalianensisDJTU-SJ5)，已經保藏于中國典型培養 物保藏中心，保藏編號CCTCCN0:M2014542,保藏地址為：中國.武漢.武漢大學，保藏日期 為2014年11月2日。
【附圖說明】
[0012] 圖1為本發明的實驗流程圖；
[0013] 圖2為苯并芘的降解圖；
[0014] 圖3為芘的降解圖；
[0015] 圖4為菲的降解圖；
[0016] 圖5為萘的降解圖；
[0017] 圖6為苊的降解圖；
[0018] 圖7為苯并芘的色譜圖；
[0019] 圖8為菌株T降解苯并芘的代謝產物的LC-MS分析和推測的結構圖，其中圖8a產 物1的離子碎片，圖8b產物2的離子碎片，圖8c產物3的離子碎片；
[0020] 圖9為尖孢鐮刀菌；
[0021] 圖10為踝節菌；
[0022] 圖11為殘孔菌；
[0023]圖12為菌株T在優化條件下對花、菲、萘、苊的降解圖；
[0024] 圖13為菌株R在優化條件下對花、菲、萘、苊的降解圖；
[0025] 圖14為混合菌T+R在優化條件下對花、菲、萘、苊的降解圖；
[0026] 圖15為pH對T和R的絮凝活性的影響；
[0027] 圖16為時間對T和R絮凝活性及生長的影響；
[0028] 圖17為發酵溫度對T和R絮凝活性的影響；
[0029] 圖18為碳源種類對T和R絮凝活性的影響；
[0030] 圖19為菌株的絮凝圖。從左至右：對照（未加菌），T(加踝節菌），R(加殘孔菌）；
[0031] 圖20為絮凝劑T和R對四種PAHs的降解。
【具體實施方式】
[0032] 下面結合具體實施例對本發明的技術方案作進一步詳細地說明。
[0033] 實施例1產物液相實驗
[0034] 1. 1實驗試劑
[0035] 苯并芘（97% )，CAS號：50-32-8,百靈威科技有限公司；芘（97% )，CAS號： 129-00-0,阿拉丁試劑有限公司；菲（97% )，CAS號：85-01-8,阿拉丁公司；萘（95% )，CAS 號：91-20-3,上海信裕生物科技有限公司；苊（95% )，CAS號：83-32-9,上海信裕。
[0036]1. 2培養基及溶液
[0037] (1)多環芳烴丙酮溶液：取0. 25g多環芳烴溶于50mL丙酮溶液中，配成5g/L儲備 液備用。
[0038] (2)種子培養基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，蒸餾水1000mL。
[0039] (3)無機鹽培養基：磷酸緩沖溶液 6mL、MgS04 ·Η20 (24. 5g/L) 3mL、CaCl2 (lg/L)lmL、 FeCl3 (lg/L) 2mL、ZnS04 ·H20 (lg/L) 2mL、MnS04 ·H20 (0· 5g/L)lmL，定容至 1L。
[0040] (4)磷酸緩沖溶液：K2HP04 · 3H20 26. 12g、KH2P04 ·H20 6. 8g、NH4C1 5.Og、 Na2HP04 · 12H2035. 8g，蒸餾水lOOOmL。
[0041] 1.3多環芳烴降解實驗
[0042] 本實驗通過均勻設計優化，提高菌株對高濃度底物的降解率，測定菌株T在7天內 對100mg/L花、150mg/L菲、200mg/L萘和200mg/L危的降解，同時證實菌株Τ對20mg/L苯 并芘的降解效果。
[0043] (1)菌懸液制備：挑取純化后的菌株T放入100mL種子培養基中進行搖瓶培養， 30°C，150r/min振蕩培養48h。對20mL培養液，在6000r/min離心20min，去掉上清液保留 菌體，用磷酸緩沖液清洗并離心，再用該緩沖液將清洗后的菌體配成5mL較濃的菌懸液。
[0044] (2)苯并芘降解實驗：取lmLlg/L苯并芘丙酮溶液加入無機鹽培養液中，使體系 體積為50mL，苯并芘濃度20mg/L。用紗布封住瓶口，35°C，150r/min振蕩50min，促使培養 液中的丙酮揮發，以減少丙酮對菌體的毒副作用。加入菌懸液，30°C，150r/min振蕩培養7 天，測定降解率。
[0045] (3)芘、菲、萘、苊的降解過程同上述苯并芘的降解實驗。
[0046] 1. 4固相萃取-液相色譜檢測降解產物
[0047] 具體過程：降解液6000r/min離心25min。去掉菌體收集上清液，用0. 22μπι濾 膜進行過濾處理，然后用固相萃取儀將溶液中的苯并芘洗脫出來。萃取采用C-18固相萃 取柱，二氯甲烷作洗脫溶劑，萃取過程：①活化C-18柱子：依次用10mL二氯甲烷、10mL甲 醇、10mL超純水沖洗柱子，沖洗速度3mL/min;②過樣：加入待萃取樣品，洗脫速度1~2mL/ min，使待測組分保留在吸附柱上，真空抽濾lOmin;③洗脫：用10mL二氯甲燒以1~2mL/ min速率通過吸附柱，將待測組分洗脫出來。洗脫樣品在60°C水浴鍋濃縮至lmL，將樣品真 空抽干，抽干后用2mL乙腈溶解。
[0048] 色譜條件：色譜柱為C18柱，250X4. 6X5μm，柱溫30°C，進樣量10μL，流速lmL/ min，流動相水/乙腈，紫外檢測波長242nm，洗脫梯度表1:
[0049]表1
[0050]
[0051] 1.5液相色譜結果
[0052] 下述色譜圖中1、2、3號色譜線分別為只含有菌株的培養液、底物、含有菌株和底 物的培養液。液相色譜儀：島津LC-10ATVP-UV。
[0053]如圖2所示，可見兩個明顯的產物峰，其中底物c(苯并芘20mg/L)出峰時間 19. 834min;產物a出峰時間為1. 821min，產物b出峰時間10. 896min。
[0054]圖3為芘的降解圖，b為底物芘（lOOmg/L)，出峰時間14. 654min。推測有1個主 要產物峰為a，出峰時間為10. 904min。從峰面積可見芘的降解率偏低，可能是由于芘濃度 偏大，對菌體有一定的毒副作用，使得代謝效果較差。
[0055]圖4為菲的降解圖，圖中a代表底物菲（150mg/L)，出峰時間13. 641min。未見產物 峰，可能是萃取過程中底物菲和其產物未被洗脫出來，也可能是菌株對菲的轉化較為徹底， 將其代謝為小分子的終產物。
[0056]圖5為萘的降解圖，a代表底