抗人pcsk9單克隆抗體的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明為基因工程抗體藥物領域，特別是抗人PCSK9的單克隆抗體領域。本發明 涉及人源性功能性抗人PCSK9單克隆抗體，以及這類抗體在治療人PCSK9介導的疾病中的 用途。
【背景技術】
[0002] 心血管疾病是目前我國首位的死亡原因，其中動脈粥樣硬化引起的心臟病、腦卒 中和外周動脈疾病是導致死亡的主要原因，而低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C)水平升高是動 脈粥樣硬化性心血管疾病最大的危險因素。他汀類藥物是目前降低LDL-C最有效的藥物， 但是仍有部分患者的血脂水平未能達標，以及有些患者不能耐受他汀類藥物。因此，需要尋 找他汀以外的強效降膽固醇藥物，以降低動脈粥樣硬化性心血管疾病的風險。
[0003]前蛋白枯草溶菌素轉化酶 9(proproteinconvertasesubtilisinkexin9， PCSK9)，又稱為神經凋亡調節轉化酶 1(neuralapoptosis-regulatedconvertase1， NARC-1)。PCSK9蛋白主要在肝臟中合成和分泌，PCSK9蛋白進入血液循環后，在肝臟與低密 度脂蛋白受體（thelow-densitylipoproteinreceptor,LDLR)結合，介導LDLR降解，從 而降低肝臟對LDL-C的清除能力，升高血漿LDL-C水平。PCSK9基因敲除的小鼠表現出血漿 膽固醇水平大約降低50%，而且使他汀類藥物降低血漿膽固醇的靈敏度變高（RashidS，et al2005，ProcNathAcadSci102:5374-5379)。
[0004] 抗PCSK9單克隆抗體可有效阻止PCSK9與LDL-R結合，從而發揮強效降膽固醇的 作用，可用于他汀治療未達標或他汀不耐受的高膽固醇血癥的患者。
[0005] 目前安進研發的PCSK9抑制劑Repatha(Evolocumab)和賽諾菲/再生元研發的 PCSK9抑制劑Praluent(Alirocumab)都已經獲得歐洲和美國FDA的批準上市，用于治療原 發性高膽固醇血癥、混合型高脂血癥和家族性高膽固醇血癥。但是本領域仍然需要更多適 于治療患者的改善的抗PCSK9抗體。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于提供一種新型抗人PCSK9的單克隆抗體或其片段。由本發明涉 及的抗體基因可變區的序列，可構建全長的抗體分子作為藥物用于臨床上由人PCSK9介導 的疾病使用。這些適應癥包括但不局限于下列：原發性高膽固醇血癥、混合型高脂血癥和家 族性高膽固醇血癥。
[0007] 本發明從先前構建的大容量天然人源噬菌體抗體庫(抗人IL-17單克隆抗體，專 利申請號201510097117. 0)中篩選并優化得到了全人源抗PCSK9單克隆抗體。
[0008] 本發明的抗體為全人源的單克隆抗體，拮抗至少一種與PCSK9或其部分相關的體 外或體內生物活性。
[0009] 在一個實施例中，本發明抗體的特征在于能夠有效抑制PCSK9結合重組人LDLR胞 外區EGF-AB結構域。
[0010] 在一個實施例中，本發明抗體的特征在于對人PCSK9具有強結合親和力，親和 力優于（H7B12-IgG4)或與安進公司的同類抗體Evolocumab以及賽諾菲公司的同類抗體 Alirocumab相似。
[0011] 在一個實施例中，本發明抗PCSK9單克隆抗體含有重鏈可變區多肽，該多肽含有3 個HCDR，其特征在于：所述HCDR1序列為GYX1X2X3NY;所述HCDR2序列為SFYNGN;所述 HCDR3序列為GYVMDX4。其中X1X2X3序列為AIY、TLN或者ALY;X4為I或者F。而且其 中HCDRs序列根據Chothia定義。優選地，本發明抗PCSK9單克隆抗體包含重鏈可變區多 肽，該多肽具有選自SEQIDNO:16-19的氨基酸序列。
[0012] 在另一個實施例中，本發明抗PCSK9單克隆抗體含有輕鏈可變區多肽，該多肽 含有3個IXDR序列，其特征在于：所述IXDR1序列為RASQSINNWLD;所述IXDR2序列為 AASTRPS;所述LCDR3序列為QQDQDIPPT。而且其中LCDRs定義根據Chothia定義。優選地， 本發明抗PCSK9單克隆抗體包含輕鏈可變區多肽，該多肽具有選自SEQIDN0:20的氨基酸 序列。
[0013] 在優選的實施例中，本發明抗PCSK9單克隆抗體含有（i):含HCDR1、HCDR2、和 HCDR3序列的重鏈可變區，其特征在于：所述HCDR1序列為GYX1X2X3NY;所述HCDR2序列 為SFYNGN;所述HCDR3序列為GYVMDX4 ;其中X1X2X3序列為AIY、TLN或者ALY;X4為I或 者F。而且其中HCDRs序列根據Chothia定義。（ii):含IXDR1、IXDR2、和IXDR3序列的輕 鏈可變區，其特征在于：所述IXDR1序列為RASQSINNWLD;所述IXDR2序列為AASTRPS;所述 LCDR3序列為QQDQDIPPT。而且其中LCDRs定義根據Chothia定義。
[0014] 在更優選的實施例中，本發明抗PCSK9單克隆抗體的重鏈可變區序列為SEQID NO:16,輕鏈可變區序列為SEQIDNO:20;或重鏈可變區序列為SEQIDNO:17,輕鏈可變區 序列為SEQIDN0:20;或重鏈可變區序列為SEQIDN0:18,輕鏈可變區序列為SEQIDN0: 20;或重鏈可變區序列為SEQIDNO:19,輕鏈可變區序列為SEQIDNO:20。
[0015] 本發明抗PCSK9單克隆抗體可包含或由完整的抗體（即全長)、基本上完整的抗體 或其抗原結合部分，例如Fab片段、F(ab'）2片段或單鏈Fv片段組成。
[0016] 本發明抗PCSK9單克隆抗體包括可變區和恒定區，其中抗體重鏈恒定區可以是 IgGl亞型（SeqID7)、IgG2(SeqID8)或者IgG4亞型（SeqID9)，輕鏈恒定區可以是 kappa亞型（SeqID10)或者Lambda亞型（seqID11)。
[0017] 本發明所述的單克隆抗體或其片段是全人源的。
[0018] 本發明抗體的親和力可以在標準測試方法中進行證明。簡言之，測量使用儀器 Biacore3000,將抗人Fe段的抗體偶聯至芯片CM5的表面上，稀釋抗體蛋白至合適濃度， 保證200RU左右的抗體被抗人Fc的抗體捕獲。將抗體設置一系列的濃度梯度（ex. 100nm， 50nm，25nm，12. 5nm，6. 25nm，3. 125nm，1. 5625nm，Onm)流經固定相表面，測定各單克隆抗體 的親和力。
[0019] 在一個實施例中，分析了 6種不同抗PCSK9單抗(包括4種本發明的單抗和2種對 照單抗）抑制LDLR與PCSK9結合的能力，結果是均能有效抑制LDLR與PCSK9的結合。
[0020] 本發明抗體在人血清中的穩定性可以在標準測試方法中進行證明。簡言之，取過 濾去菌的單抗樣品，分別稀釋于200ul無菌的正常人混合血清或PBS至終濃度30ug/ml， 混勻后置37°C水浴放置12天（288小時)。12天后，利用ELISA分析血清樣品（A:Ab/ normalhumanserum)，PBS樣品（B:Ab/PBS)和凍存的單抗樣品（C:Ab)與huPCSK9 的結 合，并分別比較各單抗樣品結合huPCSK9能力的變化(A/C)。結果表明本發明中的四株抗 huPCSK9單抗具有好的血清穩定性。
[0021] 本發明抗體的抑制PCSK9誘導細胞表面LDLR下調的活性可以在標準測試方 法中進行證明。簡言之，將HEK293細胞密度調整至8*10E5cells/ml，接種于24孔板 (500ul/孔)。然后在細胞中加入抗體和PCSK9,懸浮培養3h。然后分別收集各孔中細 胞，用 1%BSA-PBS洗滌 2 次，然后與FITC-anti-LDLR單抗（SinoBiologicalInc.Cat# 10231-R301-F)于冰上孵育45分鐘，用PBS洗滌2次后，用BD公司的AccuriC6流式細胞 儀分析FITC信號。以未處理的HEK293細胞為對照，比較各種處理后細胞表面LDLR的水平。 結果顯示本發明的抗PCSK9單抗（20ug/ml)能夠明顯抑制PCSK9誘導的LDLR水平下調。
[0022] 本發明抗體抑制PCSK9誘導細胞攝取LDL-C能力的活性可以在標準測試方法中 進行證明。簡言之，將HEK293細胞密度調整至8*10E5cells/ml，接種于24孔板（500ul/ 孔)。然后在細胞中加入PCSK9和抗體，懸浮培養2. 5h。然后再分別在每個孔中補加B0DIPY FLLDL(Invitrogen，Cat#:L3483)至終濃度6ug/ml，繼續懸浮培養2.5h。然后分別收集 各孔中細胞，用PBS洗滌2次后，用BD公司的AccuriC6流式細胞儀分析B0DIPY信號（激 發波長488nM，發射波長520)。以未處理的HEK293細胞為對照，比較各種處理后細胞攝取 LDL-C的水平。結果顯示本發明的多種抗PCSK9單抗（20ug/ml)能夠明顯抑制PCSK9誘導 的HEK293細胞攝取LDL-C水平的下調。
[0023]
【附圖說明】
[0024] 圖1:單抗抑制PCSK9結合人LDLR胞外區EGF-AB結構域。
[0025] 圖2 :抗人PCSK9單克隆抗體競爭LDLR結合人PCSK9。
[0026] 圖3 :不同抗huPCSK9單抗在在人血清中的穩定性分析。
[0027] 圖4 :抗PCSK9單抗抑制PCSK9誘導的HEK293細胞表面的LDLR下調（其中 anti_IL17為一株抗IL17的單抗；Aliro為抗PCSK9的對照單抗Alirocumab;Evolo為抗 PCSK9的對照抗體Evolocumab;H4H4,H7B12,H8A7,H8F4為四株抗PCSK9的單抗）。
[0028] 圖5:抗PCSK9單抗抑制PCSK9誘導的HEK293細胞攝取LDL-C能力的下調（其中 anti_IL17為一株抗IL17的單抗；Aliro為抗PCSK9的對照單抗Alirocumab;Evolo為抗 PCSK9的對照抗體Evolocumab;H4H4,H7B12,H8A7,H8F4為四株抗PCSK9的單抗）。
[0029]
【具體實施方式】
[0030] 以下實施例僅僅對本發明進行進一步的說明，不應理解為對本發明的限制。
[0031] 實施例1:各種重組蛋白的制備。
[0032] 制備抗PCSK9單抗的過程中需要用到多種不同的重組蛋白，包括人PCSK9 (huPCSK9，SeqIDNo:l)，小鼠PCSK9(moPCSK9,SeqIDNo:2 )和獼猴PCSK9(mmPCSK9, SeqIDNo:3)，人LDLR胞外區（EGF_AB，SeqIDNo:4 )，以及重組抗體。而這些蛋白都 有大量的翻譯后修飾(如：糖基化或二硫鍵等)，因而利用哺乳動物細胞表達系統將更有利 于保持重組蛋白的結構和功能。此外，為了方便純化，非抗體類的重組蛋白在C端添加了His-tag(SeqIDNo:5 )或者鼠抗體的Fc段（mFc，SeqIDNo:6)。重組抗體制備時，抗 體重鏈恒定區可以是IgGl亞型（SeqIDNo:7 )，IgG2亞型（SeqIDNo:8)或者IgG4亞型 (