抗口蹄疫o型（o/gx/09-7）病毒的單克隆抗體組合及檢測該病毒的elisa試劑盒、金標紙層 ...的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，涉及口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒的單克隆抗體組合、 分泌抗體的雜交瘤細胞株以及該抗體組合在檢測口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒中的應用。
【背景技術】
[0002] 口蹄疫（Foot-and-mouthDisease，FMD)屬一類傳染病，俗名 "口瘡"、"辟癀"，是 由口蹄疫病毒（Foot-and-mouthDiseaseVirus，FMDV)感染引起的偶蹄動物共患的急性、 熱性、接觸性傳染病，其臨床特征為口腔粘膜、蹄部和乳房皮膚發生水皰。口蹄疫病毒主要 侵害偶蹄獸，偶見于人和其它動物，其主要宿主包括豬、牛、羊等主要家畜和其它家養、野生 偶蹄動物等，易感動物多達70多種，最易感染的動物是牛、豬、駱駝、羊、鹿等，野豬、野牛等 野生動物也易感染此病。口蹄疫傳播途徑多、速度快，曾多次在世界范圍內暴發流行，造成 巨大政治、經濟損失。口蹄疫在亞洲、非洲和中東以及南美均有流行，在非流行區也有散發 病例。鑒于此，世界動物衛生組織（法語：〇fficeinternationaldes6pizooties，0IE，也 稱"國際獸疫局0ΙΕ)將其列為A類傳染病之首。目前，有三分之二的0ΙΕ成員國流行口蹄 疫，時刻威脅著無口蹄疫國家和地區的家畜安全和畜產品貿易。
[0003] 口蹄疫發病后一般不致死，但會使病獸的口、蹄部出現大量水皰，高燒不退，使實 際畜產量銳減。另外，有個別口蹄疫病毒的變種可傳染給人。因此，每次爆發后只能屠宰和 集體焚毀染病牲畜以絕后患。由于口蹄疫傳播迅速、難于防治、補救措施少，被稱為畜牧業 的"頭號殺手"。我國對口蹄疫的預防主要通過疫苗注射接種，發生口蹄疫的則捕殺。
[0004] 口蹄疫病毒（FMDV)是偶蹄類動物高度傳染性疾病（口蹄疫）的病原，屬于微核糖 核酸（小RNA)病毒科（Picornaviridae) 口蹄疫病毒屬（Aphthovirus)，其最大顆粒直徑為 23納米，最小顆粒直徑為7-8納米，在病毒的中心為一條單鏈的正鏈RNA，由大約8000個堿 基組成，是感染和遺傳的基礎，周圍包裹著的蛋白質決定了病毒的抗原性、免疫性和血清學 反應能力，病毒外殼為對稱的20面體。
[0005] 目前，口蹄疫病毒在全世界主要有0、六、(：、3六1'1、3六了2、3六了3(即南非口蹄疫病毒1、 2、3型）和Asial(亞洲1型）7個血清型，以及65個以上亞型。各型之間幾乎沒有免疫保 護力，感染了一型口蹄疫的動物仍可感染另一型口蹄疫病毒而發病，因此常常用多價疫苗 來降低患口蹄疫的風險。0型口蹄疫為全世界流行最廣的一個血清型，我國流行的口蹄疫主 要為0、A、C三型及ZB型（云南保山型）。口蹄疫0型包含多種毒株：0/GX/09-7、0/Mya98/ XJ/2010、0/Mya98/BY/2010、0/JMS/2000 等。其中，口蹄疫 0 型（0/GX/09-7)病毒是由中國 獸醫藥品監察所提供，屬于Cathay拓撲型新豬毒，該毒株株對乳鼠的適應性較好，毒力較 強；在BHK-21細胞上適應性好，遺傳穩定；對豬毒力較強；毒株具有較廣的抗原譜；1毫升 抗原表達量可達3微克以上，每毫升TCID5。可達10 7·5以上。
[0006]目前，口蹄疫滅活疫苗是預防該病發生的主要有效手段，主要通過將口蹄疫病毒 體外培養后、滅活，然后與乳化劑混合制成免疫疫苗。
[0007]FMDV的免疫是依賴T細胞的B細胞應答，疫苗接種主要誘導中和抗體的產生。疫 苗接種是特異性預防FMDV的可靠和有效手段，安全有效的疫苗是成功預防、控制乃至最終 消滅FMDV的先決條件。FMDV弱毒疫苗和滅活疫苗等常規疫苗都具有良好的免疫原性，在 預防和控制FMDV的過程中發揮著重要作用。隨著分子生物學技術的飛速發展，FMDV基因 工程疫苗如亞單位疫苗、可飼疫苗、合成肽疫苗、蛋白質載體疫苗、基因缺失疫苗、活載體疫 苗、核酸疫苗等不斷涌現。目前，常見的是口蹄疫多種毒株制備的多價疫苗，如口蹄疫〇型 (0/GX/09-7)和口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)混合制備成的雙組份疫苗。疫苗生產企業 目前常采用蔗糖密度梯度離心法測量口蹄疫病毒的含量，但是無法對多組份疫苗的某種毒 株進行單獨定量。
[0008] 目前，對口蹄疫的檢測和診斷，主要基于臨床判斷以及PCR分子檢測。PCR是一個 高靈敏的方法，但特異性存在不足，對口蹄疫的確診還需要配合核酸測序。因此，這個方法 成本高、操作復雜、對人員的要求也高。
[0009] 基于抗原抗體的免疫學檢測，因操作簡單、靈敏度高、特異性強、儀器設備便宜等 優點已經被廣泛使用在臨床檢測上。目前，市場上偶見能夠檢測口蹄疫抗原的酶聯免疫 檢測試劑盒，但是大都采用了多克隆抗體制成，比如中國農業科學院蘭州獸醫研究所開 發、生產的0型口蹄疫146S抗原定量ELISA檢測試劑盒，該試劑盒已經申報專利（專利 號CN103076451A)，該試劑盒采用了 0型口蹄疫的兔抗血清和豚鼠抗血清兩種多克隆抗體 制成，但是無法區分0型的不同毒株，比如新疆株（0/Mya98/XJ/2010株）和廣西株（0/ GX/09-7株），因而就無法對多組份0型疫苗中的每種0型口蹄疫146S抗原進行單獨定量， 其主要的原因就在于多克隆抗體針對多種抗原表位，而不同的血清型尤其是同一血清型的 不同毒株之間可能會存在相同的抗原表位。因此采用多克隆抗體去特異性檢測口蹄疫不同 的毒株是不可能成功的，尤其是同一血清型不同的毒株。
[0010] 單克隆抗體因其針對的抗原位點單一，特異性較好，并且生產的重復性優于多克 隆抗體，目前在很多臨床檢測中被采用。國內偶見有制備口蹄疫單克隆抗體的研究，但尚不 足以應用到口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒的檢測，獲得特異性以及應用性好的單克隆抗體 及能夠將其應用于口蹄疫〇型（0/GX/09-7)病毒的檢測仍是研究人員的努力目標。
【發明內容】
[0011] 本發明的第一個目的是提供用于檢測口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒的單克隆抗體 組合。
[0012] 本發明提供的用于檢測口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒的單克隆抗體組合，包 括口蹄疫〇型（0/GX/09-7)病毒的特異性單克隆抗體6D6anti和非特異性單克隆抗體 2H10anti。其中：
[0013] 所述特異性單克隆抗體6D6anti其重鏈可變區具有序列表中SEQIDNo:1的氨基 酸殘基序列或將序列表中SEQIDNo:1的氨基酸殘基序列經過一至十個氨基酸殘基的取 代、缺失或添加且可與口蹄疫〇型（0/GX/09-7)病毒特異結合的多肽，輕鏈可變區具有序列 表中SEQIDNo: 2的氨基酸殘基序列或將序列表中SEQIDNo: 2的氨基酸殘基序列經過 一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且可與口蹄疫〇型（0/GX/09-7)病毒特異結合的 多肽。序列表中的SEQIDNo:1由113個氨基酸殘基組成，序列表中的SEQIDNo:2由99 個氨基酸殘基組成。
[0014] 編碼單克隆抗體6D6anti的基因^D6anti)，其重鏈可變區編碼基因具有序列表 中SEQIDNo:3的DNA序列或編碼序列表中SEQIDNo:l的DNA序列或在高嚴謹條件下可 與序列表中SEQIDNo:3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列，其輕鏈可變區編碼基因具有 序列表中SEQIDNo:4的DNA序列或編碼序列表中SEQIDNo:2的DNA序列或在高嚴謹條 件下可與序列表中SEQIDNo:4限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；所述高嚴謹條件為在 0. 1XSSPE(或0. 1XSSC)、0. 1%SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。序列表中的SEQ IDNo:3由339個堿基組成，編碼具有序列表中SEQIDNo:1的氨基酸殘基序列的蛋白質， 序列表中的SEQIDNo:4由297個堿基組成，編碼具有序列表中SEQIDNo:2的氨基酸殘 基序列的蛋白質。
[0015] 所述非特異性單克隆抗體2H10anti的重鏈可變區具有序列表中SEQIDNo:5的 氨基酸殘基序列或將序列表中SEQIDNo:5的氨基酸殘基序列經過一至十個氨基酸殘基的 取代、缺失或添加且可與口蹄疫〇型（0/GX/09-7)病毒非特異結合的多肽，輕鏈可變區具有 序列表中SEQIDNo:6的氨基酸殘基序列或將序列表中SEQIDNo: 6的氨基酸殘基序列 經過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且可與口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒非特異 結合的多肽。序列表中的SEQIDNo:5由117個氨基酸殘基組成，序列表中的SEQIDNo: 6由104個氨基酸殘基組成。
[0016] 編碼單克隆抗體2H10anti的基因（2H10anti)，其重鏈可變區編碼基因具有序列 表中SEQIDNo:7的DNA序列或編碼序列表中SEQIDNo:5的DNA序列或在高嚴謹條件下 可與序列表中SEQIDNo:7限定的DNA序列雜交的核苷酸序列，其輕鏈可變區編碼基因具 有序列表中SEQIDNo:8的DNA序列或編碼序列表中SEQIDNo:6的DNA序列或在高嚴 謹條件下可與序列表中SEQIDNo:8限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；所述高嚴謹條件 為在0. 1XSSPE(或0. 1XSSC)、0. 1%SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。序列表中的 SEQIDNo:7由351個堿基組成，編碼具有序列表中SEQIDNo:5的氨基酸殘基序列的蛋 白質，序列表中的SEQIDNo:8由312個堿基組成，編碼具有序列表中SEQIDNo:6的氨基 酸殘基序列的蛋白質。
[0017] 含有基因6D6anti和/或2H10anti的表達載體、轉基因細胞系或宿主菌均屬于本 發明。
[0018] 本發明口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒的特異性單克隆抗體6D6anti和非特異性單 克隆抗體2H10anti，是以口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒為免疫原免疫小鼠（Musmusculus) 首先獲得雜交瘤細胞株6D6和2H10,再由所述細胞株持續、穩定分泌得到。其中能分泌抗口 蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒的特異性單克隆抗體的細胞株6D6,已于2015年9月16日保 藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為：北京市朝陽區北辰西 路1號院3號，保藏編號為CGMCCNo. 11196 ;分泌抗口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒的非特 異性單克隆抗體的雜交瘤細胞株2H10,已于2015年9月16日保藏于中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物中心，保藏地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏編號為 CGMCCNo. 11195。
[0019] 獲得雜交瘤細胞株6D6或2H10的方法，可包括以下步驟：
[0020] 1)用口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒作為免疫原免疫動物；
[0021] 2)分離免疫動物的脾細胞，將其與骨髓瘤細胞融合，形成雜交瘤；
[0022] 3)篩選雜交瘤細胞，得到雜交瘤細胞株6D6或2H10。
[0023] 獲得單克隆抗體6D6anti或2H10anti的方法，是在上述步驟的基礎上增加以下步 驟：
[0024] 4)從雜交瘤細胞株6D6或2H10的培養液或接種雜交瘤細胞株6D6或2H10的動物 的腹水液中分離并純化出單克隆抗體。
[0025] 在上述方法中，步驟1)中的口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒可為活病毒或滅活病 毒，優選為滅活病毒，濃度為10-1000μg/mL;用于制備單克隆抗體的免疫動物可為小鼠、 大鼠、兔、山羊、綿羊、豬、驢、馬等哺乳動物，優選為小鼠。
[0026] 步驟2)中當被免疫動物的血清抗體水平達到峰值時，可分離動物的脾細胞并制 備成單細胞懸液。必要時，可使用免疫吸附方法篩選脾細胞，并在適當的融合劑（如聚乙二 醇）的誘導下與骨髓瘤細胞（優選為小鼠骨髓瘤細胞SP2/0)融合以形成雜交瘤。
[0027] 步驟3)中可以在選擇性培養基（如HAT培養基）中培養以篩選融合的雜交瘤細 胞，并進一步可使用流式細胞術、Western印跡法、免疫沉淀法等方法鑒定所需的陽性抗性 細胞株。
[0028] 步驟4)中可于體外（如在組織培養瓶或多孔纖維反應器中）或體內（小鼠腹 水）培養分泌口蹄疫〇型（0/GX/09-7)病毒單克隆抗體6D6anti或2H10anti的雜交瘤細 胞株6D6或2H10,并從細胞培養液或小鼠腹水液中收集和純化出單克隆抗體6D6anti或 2H10anti〇
[0029] 本發明還提供了所述單克隆抗體組合在口蹄疫0型（0/GX/09-7)病毒的ELISA 檢測中的應用，是用特異性單克隆抗體6D6anti作為包被抗體，以非特異性單克隆抗體 2H10anti作為酶標抗體的雙抗夾心ELISA檢測方法，包括以下步驟：
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