用于鑒別小麥矮腥黑粉菌和小麥光腥黑粉菌的抗原及多克隆抗體的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及用于鑒別小麥矮腥黑粉菌和小麥光腥黑粉菌的抗原及多克隆抗體，屬 于植物病害防治領域。
【背景技術】
[0002] 由小麥光腥黑粉菌（Tilletiafoetida(Wallr. )Liro，TFL)引起的小麥光腥黑粉 病是世界上最具破壞性的小麥病害之一，在我國北方麥區發生較多，是北京市補充農業植 物檢疫性有害生物。此病菌孢子含量超過0.6%即可引起嚴重中毒現象，人畜食后重者可引 起惡心、嘔吐甚至昏迷等中毒癥狀（Goats, 1999 ;Hoffman，1982)，嚴重影響小麥品質及商 業價值。
[0003] 小麥矮腥黑穗病是由小麥矮腥黑粉菌（TilletiacontroversaKUhn，TCK)引起的 重要國際檢疫性病害，也是我國對外檢疫的一類危險性植物病害。該病害危害大、防治難， 一旦傳入會給小麥生產帶來毀滅性危害，通常發病率約等于小麥產量損失率。
[0004] 小麥光腥黑粉菌和小麥矮腥黑粉菌的田間侵染癥狀以及孢子形態和顏色十分相 似，在田間觀察時很難區分。目前，常用的鑒別方法是PCR反應或顯微鏡檢測，但這兩種方 法都需要用到儀器，只能在實驗室內進行，并且PCR反應耗時長，工序復雜。因此，需要研發 一種簡便、快速、準確的方法來鑒別小麥光腥黑粉菌和小麥矮腥黑粉菌，從而采取相應的防 治措施，控制病害的進一步發展。
【發明內容】
[0005] 為滿足上述領域的需求，本發明提供一種抗體，該抗體能夠特異識別小麥矮腥黑 粉菌，從而將小麥矮腥黑粉菌和小麥光腥黑粉菌區別開來。
[0006] 本發明請求保護的技術方案如下：
[0007] -種用于制備鑒別小麥矮腥黑粉菌和小麥光腥黑粉菌的多克隆抗體的半抗原，其 氨基酸序列如SEQIDN0 :1所示。
[0008] -種用于制備鑒別小麥矮腥黑粉菌的多克隆抗體的免疫原，其特征在于，對權利 要求1所述的半抗原進行改造和偶聯，步驟如下：
[0009] 取權利要求1所述的半抗原6mg，用lmLDMF溶解，得到溶液A;取15mgEDC和NHS， 用0. 2mLPH5. 0MES充分溶解后，加入溶液A中，室溫下攪拌24h，即可得到反應液B;稱取牛 血清白蛋白BSA50mg，使之充分溶解在3. 8mLPH7. 2的0. 1MPBS中，將反應液B逐滴緩 慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24h，在4°C下，用0.Olmol/LPBS透析3天，每天換 3次透析液；分裝，保存于_20°C備用。
[0010] -種用于免疫方法鑒別小麥矮腥黑粉菌的包被抗原，其特征在于，對權利要求1 所述的半抗原進行改造和偶聯，具體步驟如下：
[0011] 取權利要求1所述的半抗原4mg，用lmLDMF溶解，得到溶液A;取2. 5 %的戊二 醛200ul，加入A溶液，反應30min即可得到反應液B;稱取卵清蛋白50mg，使之充分溶解在 3. 8mL0. 1MCB中，將反應液B逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌16h，再加入硼 氫化鈉還原反應2小時，然后在4°C下，用0.Olmol/LPBS透析3天，每天換3次透析液；分 裝，保存于-20 °C備用。
[0012] 用于鑒別小麥矮腥黑粉菌和小麥光腥黑的多克隆抗體，其采用以下步驟制備而 得：
[0013] (1)以權利要求2所述的免疫原免疫家兔，篩選產生高效價全血的家兔；
[0014] (2)對選中的家兔采取全血，分離純化獲得多克隆抗體；
[0015] 所述免疫包括多次，初次免疫0. 2mg/次/只，第二次開始0.lmg/次/只。
[0016] 篩選產生高效價全血的家兔指采集被免疫的家兔的血清，進行競爭抑制檢測試 驗。
[0017] 用于鑒別小麥矮腥黑粉菌和小麥光腥黑粉菌的方法，其特征在于，包括如下步 驟：
[0018]a、包板：將待測樣品的孢子用抗原稀釋液稀釋200倍，混勻并加入酶標板，每孔各 100ul，37°C孵育2小時，洗板一次，拍干；
[0019] b、封閉：每孔加入150ul封閉液進行封閉，37°C孵育2小時，棄液，拍干，備用；
[0020] c、加抗體：用抗體稀釋液將權利要求4所述的多克隆抗體稀釋9000倍，每孔各加 入50ul，37°C孵育30分鐘；
[0021] d、洗滌：洗板3_5次，每次間隔30秒，拍干；
[0022] e、加酶標二抗：加入稀釋1000倍的HRP標記的羊抗兔抗體，每孔100ul，37°C孵育 30分鐘；
[0023] f、洗滌；洗板3-5次，每次間隔30秒，拍干；
[0024] g、顯色：加入等量A/B底物顯色液，每孔100ul，37°C孵育15分鐘；
[0025] h、終止：加入終止液終止反應；
[0026]i、讀數：所使用酶標儀的波長為450nm/630nm，讀取0D值；
[0027] 若0D值大小為1. 8~2. 0,則待測樣品為小麥矮腥黑粉菌。
[0028] 本發明提供的抗原蛋白，其氨基酸序列來自小麥矮腥黑粉菌和小麥光腥黑粉菌的 共有蛋白序列。采用所述抗原蛋白免疫實驗動物，獲得的抗體能夠特異識別小麥矮腥黑粉 菌，而不能與小麥光腥黑粉菌產生抗原抗體反應，因此能夠用于鑒別田間難以區分的小麥 矮腥黑穗病和小麥光腥黑穗病。所述抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體。
[0029] 本發明用于鑒別小麥矮腥黑粉菌和小麥光腥黑粉菌的方法，操作十分簡便，能夠 快速、準確地判斷待測樣品是小麥矮腥黑粉菌。只需取疑似小麥矮腥黑粉菌的孢子與本發 明抗體在適當的反應條件下進行反應，如果出現抗原抗體反應，則該樣品是小麥矮腥黑粉 菌，如果不能發生抗原抗體反應，則該樣品是小麥光腥黑粉菌。整個過程無需儀器，技術人 員可以攜帶相關試劑和耗材，在野外就能完成兩種黑粉菌的鑒別。
【附圖說明】
[0030] 圖1.多克隆抗體的制備流程圖，
[0031] 免疫時間安排：如表1所示，初次免疫15天后進行第二次免疫，15天后進行第三 次免疫，7天后第一次采血檢測，7天后進行第四次免疫，7天后第二次采血檢測，7天后進行 第五次免疫，7天后第三次采血檢測，以此類推，每組均完成至少6次免疫與4次采血檢測。 其中，E004組的實驗兔子免疫效果較好，為本次實驗的優選組，其免疫時間安排如表2所 不。
【具體實施方式】
[0032] 下面通過具體實施例對本發明作進一步詳細說明，需要理解的是，下述實施例僅 作為解釋和說明，而不以任何形式限制本發明的保護范圍。
[0033] 小麥矮腥黑粉菌（TilletiacontroversaKUhn):本發明所有的小麥矮腥黑 粉菌菌株為現有文獻L.GAOetal.DevelopmentofaSCARMakerbyinter-simple sequencerepeatfordignoisisofDwarfBuntofWheatandDetectionof TilletiacontroversaKUhn.FoliaMicrobiol. 55(3)，258 - 264(2010)所記載，參 見其中材料與方法部分記載的在美國由B.Goates教授分離到的分離株。另外也記 載在L.GAOetal.AnISSR-basedApproachfortheMolecularDetectionand DiagnosisofDwarfBuntofWheat,CausedbyTilletiacontroversaKu"hn.J 卩1171：(^31:11〇1159:155 - 158(2011)，為其中材料與方法部分記載的〇11313；^6〇3七68所提供 的TCK菌株。
[0034] 小麥光腥黑粉菌：本發明所使用的小麥光腥黑粉菌為現有文獻《小麥光腥黑穗菌 萌發的超微結構研究》，西北農業大學學報，1999,03期（3) : 110-112所記載的菌株。
[0035] 上述生物材料本實驗室亦有保存，可自申請日起二十年內向公眾發放用于驗證實 驗。
[0036] 以下實施例中未特別說明的生物化學試劑均為本領域常規試劑，可以通過本領域 常規方法配制而得或商購獲得，規格為實驗室純級即可。
[0037] 實施例1.用于鑒別TCK和TFL的多克隆抗體制備
[0038] 試劑與溶液：
[0039] 弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑（北京勤邦生物技術有限公司），磷酸鹽緩沖液 (PBS，0. 02M，ρΗ7· 2)，包被液（磷酸鹽緩沖液，0· 05M，ρΗ7· 4)，反應稀釋液（PBS1，0. 03M，pH7. 4+0. 05%吐溫20)，洗滌工作液（用去離子水將20X濃縮洗滌液按1 :19體積比進行 稀釋）；封閉液（在〇· 〇2mol/LPBS1中加入0· 05%BSA)，底物顯色液：由A液和B液組成， A液為過氧化氫，B液為四甲基聯苯胺；終止液（2mol/LH2S04)，酶標二抗（北京勤邦生物技 術有限公司）。
[0040] 小麥矮腥黑粉菌懸液1*105孢子/ml
[0041] 主要儀器設備：
[0042] 真空冷凍干燥機，電熱恒溫培養箱，ProteinA/G柱，電泳槽、電泳儀，酶標板，酶標 儀，低溫高速離心機，ProteinA層析柱等。
[0043] 實驗動物：新西蘭大耳兔，購自中國軍事醫學科學院。
[0044] 1、多肽合成
[0045]利用ITRAQ分析小麥矮腥黑粉菌（TCK)和小麥光腥黑粉菌（TFL)的蛋白質，得到TCK和TFL的共有蛋白序列（SEQIDNO:2)，其氨基酸序列為：
[0046]APGHRDFIKNMITGTSQADCAILIIAGGTGEFEAGISKDGQTREHALLAFTLGVRQLIVAVNKMDTTKY SEERFHEIVKETSNFIKKVGFNPKSVAFVPISGWHGDNMIEPTANMPWYKGWEKETKAGKSSGKTLLDAIDAIEPPS RPTDKPLRLPLQDVYKIGGIGTVPVGRVETGIIKAGMVVTFAPSNVTTEVKSVEMHHEQLVEGNP⑶NVGFNVKNVS VKDIRRGNVCSDSKNDPAMEAASFIAQVIVMNHPGQIGAGYAPVLDCHTAHIACKFAELVEKIDRRSGKSIEDAPKF IKSGDAAMVKMIPTKPMCVEAFNVYPPLGRFAVRDM
[0047] 根據上述共有蛋白序列設計獲得多條多肽，篩選獲得能夠區分小麥矮腥黑粉菌和 小麥光腥黑粉菌的抗原蛋白（SEQIDN0:1)，其多肽序列為：EPPSRPTDKPLRLC。由北京勤邦 生物技術有限公司對上述抗原蛋白進行化學合成，獲得半抗原。
[0048] 2、多抗制備
[0049] 半抗原偶聯：取步驟1合成的的半抗原6mg，用lmLDMF溶解，得到溶液A;取 15mgEDC和NHS，用0. 2mLPH5. 0MES充分溶解后，加入溶液A中，室溫下攪拌24h，即可得到 反應液B;稱取牛血清白蛋白BSA50mg，使之充分溶解在3. 8