一種甜菊苷生物轉化制備的甜菊糖衍生物、制備方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種甜菊苷生物轉化制備的甜菊糖衍生物、制備方法及其應用，屬于 食品化工技術領域。
【背景技術】
[0002] 甜菊糖是從菊科草本植物甜葉菊的葉、莖中提取出的一種新型天然甜味劑，是一 種天然、綠色、保健的功能食品，它有著芬芳、清涼的味道，還具有甜度高、熱能低的特點，其 甜度是蔗糖的200-300倍，而熱值僅為蔗糖額1/300,是一種可替代蔗糖非常理想的甜味 劑。隨著人類對健康、綠色的重視，甜菊糖被食品科學家稱為是未來世界最具發展前景的甜 味劑。
[0003] 甜菊糖被國際醫學界認為是人類良好的營養補充劑和保健藥品。經大量科學實驗 證明，甜菊糖有利于調節血糖和血壓，經常食用可調節血糖水平，預防高血壓，改善低血壓 癥狀；甜菊糖還具有抑制某些細菌生長和繁殖及阻止其感染的作用，能夠治療感冒和流感 及預防齲齒等病癥；甜菊糖能夠降低人對糖和脂肪的需求，調節其日常飲食，降低人們對煙 酒的需求，防止了糖尿病、肥胖癥、心臟病等疾病的發生；同時，甜菊糖還具有對皮膚修復和 改良作用，它能治療皮膚疾病，消除皺紋，去除疤痕等。
[0004] 甜菊糖可廣泛應用于食品、飲料、調味料、醫藥、日用化工、釀酒、化妝品等行業，較 使用蔗糖可節省成本約60%，且營養價值高。甜菊糖的穩定性、代謝途徑及其安全性已被 深入研究，它已經我國衛生部、輕工業部批準使用，且亦被美國食品藥品監督管理局認可為 "GRAS(-般認為是安全的）"的級別。甜菊糖作為蔗糖的天然替代品，其應用前景廣闊。
[0005] 甜菊糖雖有著眾多優勢，但是其嚴重的苦澀后味，卻阻礙了其的廣泛應用。目前， 甜菊糖口感的改善可通過酶法生物轉化來實現。已有報道，可以利用環糊精糖基轉移酶改 性甜菊糖，以改善其口感和味質，但是該酶轉移糖基的位置不專一，產物不純，且其甜度也 嚴重降低。
[0006] 甜菊雙苷向甜菊苷和萊鮑迪苷B的轉化以及甜菊苷轉化為萊鮑迪苷A和D的反應 等。這些研究相對于甜菊糖的眾多組分而言，仍微乎其微，而且其改性后的口感和味質也是 一項龐大的研究。尋求高效的生物轉化酶，轉化工藝以及新型甜菊糖衍生物仍是甜菊糖未 來的研究趨勢。
【發明內容】
[0007] 本發明解決的技術問題是：提出一種以甜菊苷為原料，通過酶法轉化生產甜菊糖 衍生物，從而改善其口感，可以較低的成本和較短的生產周期產出優質的甜菊苷生物轉化 制備的甜菊糖衍生物、制備方法及其應用。
[0008] 為了解決上述技術問題，本發明提出的技術方案是：一種甜菊苷生物轉化制備的 甜菊糖衍生物，結構式如下：
[0009]
[0010] 本發明提出的另一技術方案是：一種甜菊苷生物轉化制備的甜菊糖衍生物的制備 方法：以甜菊苷為底物，使所述底物在葡萄糖基供體存在下，在UDP-葡萄糖基轉移酶（尿苷 二磷酸葡萄糖基轉移酶）的催化作用下反應生成甜菊糖衍生物。
[0011] 優選的，所述的葡萄糖基供體為UDP-葡萄糖或由蔗糖、蔗糖合成酶和UDP組成的 UDP-葡萄糖再生循環體系。
[0012] 優選的，所述的UDP-葡萄糖基轉移酶M301，蔗糖合成酶M302,都由南京諾云生物 科技有限公司發酵生產部提供。
[0013] 優選的，UDP-葡萄糖的用量為0· 0135~5. 41g/L;蔗糖的用量為34. 23~68. 46g/ L;蔗糖合成酶的用量按濕菌體計為18. 92~94. 59g/L，
[0014] 優選的，在微生物宿主中表達UDP-葡萄糖基轉移酶，所述微生物宿主選自大腸桿 菌、芽胞桿菌、酵母、曲霉菌或畢赤酵母。
[0015] 優選的，所述反應在MgCl2濃度為0~0· 286g/L，溫度為20~37°C，pH5. 0~9. 0 的水相體系中進行，反應時間為〇. 5~72h。
[0016] 優選的，所述反應在pH8. 0的Tris-HCl緩沖液中進行。
[0017] 優選的，所述反應的糖基轉移酶的添加量為18. 92~227. 03g/L，底物起始濃度為 0· 676 ~54. 05g/L，輔酶的添加量為 0· 0135 ~5. 41g/L。
[0018] 本發明提出的另一技術方案是：一種甜菊苷生物轉化制備的甜菊糖衍生物的應 用：可應用于食品，飲料，煙草產品，調味品，日用化工產品，藥物組分，營養保健產品，口腔 衛生產品或化妝品。
[0019] 本發明的有益效果：
[0020] (1)所述的葡萄糖基供體可以為UDP-葡萄糖或由蔗糖、蔗糖合成酶和UDP組成的 UDP-葡萄糖再生循環系統。其中，優選由蔗糖、蔗糖合成酶和UDP組成的UDP-葡萄糖再生 循環系統，UDP-葡萄糖價格昂貴，采用UDP-葡萄糖再生循環系統可以大幅度的降低生產成 本。
[0021] (2)將反應所用的全部原料加入到反應液中，混勻后，置于設定的參數下，搖床震 蕩反應，反應結束時其產物轉化效率可達90%以上。通過對反應液分離提純處理即可獲取 達到要求的甜菊糖衍生物NY101產品。一個具體的分離提純方法是先經過樹脂分離處理， 再經乙醇反復結晶純化，按照該提純方法，可獲得純度高達95%的甜菊糖衍生物NY101產 品。
[0022] (3)蔗糖作為原料之一，提供糖基，由于其物理化學性質與甜菊糖及其衍生物差異 較大，故反應后可以采用樹脂分離和結晶等方式去除未反應的蔗糖和反應副產物果糖。
[0023] (4)本發明以甜菊苷、蔗糖為原料，利用生物轉化方法在所述參數下反應獲取甜菊 糖衍生物NY101產品，生產工藝綠色安全，且生產成本低、周期短，極大的提高產品的競爭 力。由于本發明操作簡便，轉化效率高，提純容易，所得產品純度高，可用于食品與飲料業， 具有重要的應用價值。
【附圖說明】
[0024] 下面結合附圖對本發明的作進一步說明。
[0025] 圖1 NY101的HPLC譜圖及其MS譜圖
[0026] 圖2 NY101的核磁氫譜圖
[0027] 圖3 NY101的核磁碳譜圖
[0028]圖 4 NY101 的二維COSY譜圖
[0029]圖 5 NY101 的二維HMQC譜圖
[0030]圖 6 NY101 的二維HMBC譜圖
【具體實施方式】
[0031] 本發明主要提供兩條制備甜菊糖衍生物NY101的路線：
[0032]路線一：
[0033]
[0034]
[0035]
[0036]
[0037] 實施例1:
[0038] 重組大腸桿菌的構建及誘導表達
[0039] 利用分子生物學和基因工程技術等獲得含有目的基因的重組大腸桿菌表達菌株， 然后將重組大腸桿菌發酵培養，誘導表達制備含有目的蛋白的重組細胞。其具體步驟如 下：
[0040] 1)合成所需的引物片段，通過PCR擴增獲得所需的UDP-葡萄糖基轉移酶M301編 碼DNA片段，并通過同源重組技術，整合到pNYK表達載體的表達框中。
[0041] 2)將重組質粒轉化到大腸桿菌中，獲得含有目的基因的工程菌J301。
[0042] 3)將1ml工程菌J301置于TB培養基中，250rpm、37°C振蕩培養至0D600 = 1. 0， 加入終濃度為0.ImMIPTG于25°C振蕩培養16h。誘導結束后以10000g，5min離心收集細 胞，置于-8〇°C儲存備用。得到了含有M301蛋白的菌體。
[0043] 同樣的，制備出含有蔗糖合成酶M302蛋白的菌體。
[0044] 實施例2 :
[0045] 以甜菊苷（stevioside)為底物酶法直接制備NY101 (路線一）
[0046] 取實施例1中的菌體M301沉淀，濕菌體重為35mg，用無菌水重懸細胞，并于冰浴中 超生波破碎細胞，即為反應所用的粗酶液。精密稱取樣品，配制成1. 85mL體系，其中甜菊苷 (stevioside)的終濃度 2. 70g/L、UDP-葡萄糖為 2. 70g/L，并加入 0· 286g/L的MgCl2;然后 加入粗酶液，并加入Tris-HCl緩沖液（0. 1M，pH8. 0)至體系為1. 85ml，起始反應。37°C恒溫 搖床以150rpm振蕩24h，100°C煮沸終止反應。13000g離心lOmin，取上清作為樣品。使用 LC-MS方法檢測反應體系中NY101的含量。實驗結果表明，NY101的轉化率約為73%。
[0047] 實施例3:
[0048] 最佳金屬離子濃度的確定
[0049] 取實施例1中的菌體M301沉淀35mg，按照實施例2中的方法，轉移至5ml離 心管中，加入終濃度為2. 70g/L的甜菊苷，UDP-葡萄糖為2. 70g/L及MgCl2，并加入0. 1M Tris-HCl緩沖液（pH8. 0)。按上述方法，取平行樣，加入1%(：12的終濃度分別為0、0.