一支 于培養板的第2列分別加入2. 5μL每加一孔均需換一個吸頭；第3列每孔加入5μL;第4 列每孔加入lOyL。加完第4孔后，將此液放入4°C恒溫冰箱保存，取Img/mL化合物（I) 儲存液一支。第5列每孔加入Img/mL化合物（I)儲存液2. 5μL;第6列每孔加入5μL。 加完后剩余藥液放入4°C恒溫冰箱保存。第一列不加藥物，作為對照組。至此在24孔培養 板中化合物（I)每行都有6個濃度，分別為0、0.5、1、2、5、10μg/mU每個濃度每列4孔(η= 4)，第一列為對照組。（3)培養細胞：加完藥后，將培養板放入C〇2培養箱內，在37°C、 5%C〇2及飽和濕度條件下，培養7天。培養至第4天時換培養液一次，按上述方法配制含有 15%胎牛血清的α-MEM培養液40m(16血胎牛血清加入34mLα-MEM培養液中），內含10μL 青霉素8μL鏈霉素（80萬U青霉素，100萬鏈霉素分別用2mL滅菌蒸饋水溶解），加入4μL solubleRANKL儲存液，然后取Ια，25(0Η)203儲存液40μΙ加入。從培養箱內取出培養板 后，倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況，每孔吸出舊培養液300μ以加入新培養液400μ以每 吸出一列更換一次吸頭，每加一孔更換一次吸頭。換液完成后，將培養板繼續放入C〇2培養 箱內，在37°C、5 %C〇2及飽和濕度條件下，再培養3天。 陽072] 2、破骨前驅細胞（P0C)培養 陽07引 2. 1全骨髓細胞的提取：如同W上所述方法，制備全骨髓細胞懸液1. 5血。
[0074] 2. 2非附著骨髓細胞的提取
[0075] (1)把用培養液沖洗過的凝膠柱，固定在固定架上；（2)緩慢向凝膠柱內注入全骨 髓細胞1. 5mU打開Ξ通，緩慢過濾；待1. 5mL全骨髓細胞滲入凝膠柱內后，再緩慢注入含 15%胎牛血清的α-MEM培養液lOmL。（3)收集含有非附著骨髓細胞的培養液共計12-15mL， 此液稱為非附著骨髓細胞原液。
[0076] 2. 3細胞數的計算（原液濃度及稀釋倍數）及達到目的濃度所需原液的量
[0077] 如同W上所述方法，計算細胞數，稀釋倍數，達到目的濃度所需原液的量。本實驗 計算細胞數為337個，推算細胞原液的濃度為16. 85X106cells/mL;稀釋倍數為8. 425,即 細胞原液需稀釋 8.425 倍才能達到需要的目的濃（2X106cells/mL);達到目的濃度所需原 液的量40血/8. 425 ^ 4. 75血，即取4. 75血細胞原液放入滅菌的50血離屯、管內，然后加入 35. 25血(40-4. 75)含15%胎牛血清的α-MEM培養液即可配成2X106cells/mL的目的細 胞懸液40mU然后加入1α，25 (0H) 2〇3儲存液40ul，操作過程應避光，即1α，25 (0H) 2〇3終濃 度為1X108Μ;加入solubleRANKL儲存液4祉，即solubleRANKL終濃度為20ng/mL;加液 過程均在超凈工作臺上操作，至此，未附著骨髓細胞懸液目的量配置完成。
[007引 2. 4培養細胞及加藥如同前述。
[0079] 3、倒置顯微鏡下觀察
[0080] 3. 1倒置顯微鏡的調節
[0081] (1)將顯微鏡合軸；
[0082] (2)將視野光圈開大至與聚光器光闊邊緣一致；
[0083] (3)將與物鏡放大倍數一致的相板放入聚光器中；
[0084] (4)把調中目鏡換到目鏡筒中，旋動調中目鏡上的調焦環至相板相環的圖像清 晰；
[00化](5)調節聚光器上的相環調中旋鈕，使兩個圓環圖像重疊成同屯、圓狀態；
[0086] (6)用普通目鏡換下調中目鏡。
[0087] 3. 2TRAP染色
[0088] (1)培養7天后，將培養板從培養箱內取出，棄去培養液；(2)加入固定液0.4mL/ 孔，固定1分鐘；（3)棄去固定液，蒸饋水沖洗四次；(4)加入染色液3-4滴/孔，用錫紙包裹 培養板；（5)在37°C、5%C〇2及飽和濕度條件下解育30分鐘后，取出培養板，棄去染色液， 蒸饋水沖洗四次，自然干燥。
[0089] 3. 3 觀察
[0090] 培養7天后將培養板從培養箱內取出，棄去培養液之前，在倒置顯微鏡下觀察不 同藥物濃度下細胞的生長狀況及形態，決定是否染色。染色后帶染色液倒置顯微鏡下觀察 染色效果。
[0091] 4、光鏡觀察
[0092] 帶染色液倒置顯微鏡下觀察后，棄去染色液，蒸饋水洗4次，自然干燥，普通光鏡 下觀察計算破骨細胞數。
[0093] 5、統計學分析
[0094] 使用SPSS16. 0統計學軟件進行分析。數據處理采用mean±SD表示，對不同藥物 濃度相同處理時間，各組與對照組之間比較，化合物（I)對破骨細胞形成及分化的影響， 得出的數據資料分析采用方差分析，從而得出藥效和藥物濃度的變化關系。 陽0巧]Ξ、結果及結論
[0096] 在全骨髓細胞培養系中，0. 5、1、2μg/mL組與對照組比較，TRAP染色陽性細胞（3 核W上）數僅為對照組的49. 04%、28. 85%、5. 77%，經統計學分析，加藥組對破骨細胞的 形成有抑制作用，當藥物濃度為1μg/mL時與對照組相比，對破骨細胞形成有顯著抑制作 用（P< 0.01)。見表 1。
[0097] 在破骨前驅細胞培養系中，0. 5、1、2、5μg/mL組與對照組相比，TRAP染色陽性細 胞（單核或2核）數僅為對照組的85. 11 %、65. 79%、37. 83%、2. 21%，經統計學分析，加藥 組對破骨前驅細胞的形成有抑制作用，當藥物濃度為2μg/mL時與對照組相比，對破骨前 驅細胞形成有顯著抑制作用（P< 0.01)。見表2。
[0098] 結論，本研究結果表明化合物（I)對破骨細胞的分化及增殖具有抑制作用，且存 在濃度依賴關系。應用化合物（I)治療W破骨細胞活性增強為主的骨破壞性疾病有可能 成為一種有前景的治療方法。
[0099] 表1全骨髓細胞培養系中TRAP染色陽性細胞（3核W上）數 陽 100]
陽103]實施例3
[0104]片劑的制備：按實施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機酸如酒石酸、或 巧樣酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，按其與賦形劑重量比為 1:7的比例加入賦形劑，制粒壓片。 陽105]實施例4 陽106] 口服液制備：按實施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機酸如酒石酸、或 巧樣酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，按常規口服液制法制成 口服液。 陽107]實施例5 陽10引膠囊劑或顆粒劑的制備：按實施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機酸如 酒石酸、或巧樣酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，按其與賦形劑 重量比為1:7的比例加入賦形劑，制成膠囊或顆粒劑。 陽109]實施例6
[0110] 注射液的制備：按實施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機酸如酒石酸、 或巧樣酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，按常規加注射用水，精 濾，灌封滅菌制成注射液。 陽111] 實施例7
[0112] 無菌粉針的制備：按實施例1方法先制得化合物（I)，W及利用有機酸如酒石 酸、或巧樣酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或憐酸制成的鹽，將其溶于無菌注射 用水中，攬拌使溶，用無菌抽濾漏斗過濾，再無菌精濾，分裝于安飯中，低溫冷凍干燥后無菌 烙封得粉針劑。
[0113] 上述實施例的作用在于說明本發明的實質性內容，但并不W此限定本發明的保護 范圍。本領域的普通技術人員應當理解，可W對本發明的技術方案進行修改或者等同替換， 而不脫離本發明技術方案的實質和保護范圍。
【主權項】
1. 具有下述結構式的化合物（I )，O2. 權利要求1所述的化合物（I )的制備方法，其特征在于包含以下操作步驟：(a)將 芫花的干燥花蕾粉碎，用70~80 %乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石 油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇 萃取物；(b)步驟（a)中乙酸乙酯萃取物用大孔樹脂除雜，先用10%乙醇洗脫8個柱體積， 再用80 %乙醇洗脫10個柱體積，收集80 %乙醇洗脫液，減壓濃縮得80 %乙醇洗脫物浸膏； (c)步驟（b)中80%乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為75:1、45:1、25:1、15:1 和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到5個組分；（d)步驟（c)中組分4用正相硅膠進一 步分離，依次用體積比為20:1、15:1和8:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e) 步驟（d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為70%的甲醇水 溶液等度洗脫，收集10~12個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物（I )。3. 根據權利要求2所述的化合物（I )的制備方法，其特征在于：所述大孔樹脂為DlOl 大孔吸附樹脂。4. 根據權利要求2所述的化合物（I )的制備方法，其特征在于：所述用乙醇熱回流 提取采用的乙醇濃度為75 %。5. -種藥物組合物，其特征在于：其中含有治療有效量的權利要求1所述的化合物 (I )和藥學上可接受的載體。6. 權利要求1所述的化合物（I )在制備治療骨破壞性疾病的藥物中的應用。7. 權利要求5所述的藥物組合物在制備治療骨破壞性疾病的藥物中的應用。
【專利摘要】本發明公開了一種新的二萜類化合物及其制備方法和醫藥用途。該化合物為首次報道，是一種結構新穎的二萜類化合物，可以從芫花的干燥花蕾中提取、分離純化得到。體外試驗證明該化合物對破骨細胞的分化及增殖具有抑制作用，且存在濃度依賴關系。應用化合物(Ⅰ)治療以破骨細胞活性增強為主的骨破壞性疾病有可能成為一種有前景的治療方法，可以進一步用來開發成治療骨破壞性疾病的藥物。
【IPC分類】A61P19/08, C07C69/618, C07C67/56, C07C67/48, C07C67/58, A61K31/216
【公開號】CN105348095
【申請號】CN201510887582
【發明人】楊輝
【申請人】西寧意格知識產權咨詢服務有限公司
【公開日】2016年2月24日
【申請日】2015年12月7日