針對程序性死亡-1(pd-1)的抗體的制作方法
【專利說明】針對程序性死亡-1(PD-1)的抗體
[0001] 對W電子形式提交的材料的參考并入
[0002] 與本申請同時提交的計算機可讀的核巧酸/氨基酸序列表通過引用整體并入本 申請，并明確為如下：一個45, 084字節的ASCII(文本）文件，命名為"716746_ST25.TXT"， 創建于2014年5月1日。 陽00引發明背景
[0004] 程序性死亡l(PD-l)(也稱為程序性細胞死亡1)是具有268個氨基酸的I型 跨膜蛋白，其最初是通過對發生調亡的小鼠T細胞系的消減雜交而被鑒定的（Ishida etal.，EmboJ.，11:3887-95 (1992))。PD-1 是T細胞調節物CD28/CTLA-4 家族的成 員，并且在活化的T細胞、B細胞和髓系細胞上表達（Greenwaldetal.,Annu.Rev. Immunol., 23:515-548 (2005);和化arpeetal.,化t.Immunol., 8:239-245 (2007))。
[0005] 已經鑒定了PD-1的兩種配體：PD配體1 (PD-Ll)和PD配體2 (PD-L2)， 兩者都屬于B7蛋白超家族（Greenwaldetal.,同上）。PD-Ll在多種細胞類型 中表達，包括肺細胞、屯、臟細胞、胸腺細胞、脾細胞和腎細胞（參見，例如，化eeman etExp.Med. ,192(7):1027-1034(2000);和Yamazakietal.,J.Immun ol.，169(10) :5538-5545(2002))。用脂多糖（LP巧和GM-CSF處理后巨隧細胞和樹突細 胞值C)上PD-L1的表達上調，并且經由T細胞和B細胞受體信號轉導，T細胞和B細胞 上PD-L1的表達得到上調。PD-L1還在多種鼠腫瘤細胞系中表達（參見，例如，Iwaiet al.'Proc.化tl.Acad.Sci.USA, 99(19):12293-12297(2002);和Blanketal.,Cancer Res.，64(3) : 1140-1145(2004))。與此相反，PD-L2呈現出更受局限的表達模式并且主要由 抗原呈遞細胞（例如，樹突細胞和巨隧細胞）和某些腫瘤細胞系表達（參見，例如，Latchman etal.,化t.Immunol. , 2(3) :261-238(2001))。無論在腫瘤微環境內的腫瘤細胞、間質或是 其他細胞上，腫瘤中PD-L1的高表達都與較差的臨床預后相關，據推測運是由于其在腫瘤 中抑制效應T細胞并上調調節性T細胞燈reg)。
[0006] PD-1負調節T細胞的活化，并且運種抑制功能與胞質結構域內的基于 免疫受體酪氨酸轉換基序（ITSM)有聯系（參見，例如，Greenwaldetal.，同 上；和Par巧etal.，Mol.Cell.Biol. ,25:9543-9553 (2005))。PD-1 的缺乏會 導致自身免疫。例如，已經顯示PD-1敲除的巧7BL/6小鼠發展出狼瘡樣綜合 癥（參見，例如，Nishimuraetal. ,Immunity, 11:141-1151 (1999)。在人類 中，PD-1基因上的單核巧酸多態性與W下疾病的高發生率相關：系統性紅斑狼 瘡、1型糖尿病、類風濕性關節炎和多發性硬化發展（參見，例如，Nielsenet al.,TissueAntigens, 62 (6) :492-497 (2003)；Bertsiasetal. ,Arthritis Rheum. ,60 (1):207-218 (2009);Nietal.，Hum.Genet. ,121 (2):223-232 (2007); Tahoorietal. ,Clin.Exp.Rheumatol. , 29(5):763-767 (2011);和Kroneretal. ,Ann. Neurol.，58(1) :50-57(2005))。PD-1的異常表達也參與一些病理（例如腫瘤的免疫逃逸和 慢性病毒感染）中的T細胞障礙（參見，例如，Barberetal.，化Uire, 439:682-687(2006); 和化a巧eetal.,同上）。
[0007] 最近的研究證實，PD-1誘導的Τ細胞抑制還參與抑制抗腫瘤免疫。例如，PD-Ll 在多種人和小鼠腫瘤上表達，并且在腫瘤上PD-1與PD-L1的結合導致T細胞的抑制W及 腫瘤的免疫逃避和保護作用值ongetal.，化t.Med. ,8:793-800(2002))。腫瘤細胞表 達PD-L1與其在體外抵抗抗腫瘤T細胞的裂解作用直接相關值ongetal.，同上；and Blanketal.,CancerRes. ,64:1140-1145(2004))。PD-1 敲除小鼠能抵抗腫瘤侵襲（Iwai etal.，Int.Immunol.，17:133-144(2005))，并且當來自PD-1敲除小鼠的Τ細胞被過繼 轉移到帶有腫瘤的小鼠中時，能高度有效地產生腫瘤排斥度lanketal.，同上）。使用 單克隆抗體阻斷PD-1的抑制性信號能增強小鼠中宿主的抗腫瘤免疫（Iwaietal.，同 上；andHiranoetal.,CancerRes.,65:1089-1096(200?5))，并且腫瘤中PD-Ll的高表 達水平與許多人癌癥類型的預后不良相關（Hamanishietal.,P;roc.化tl.Acad.Sci. USA, 104:3360-335(2007),E5;rownetImmunol., 170:1257-1266(2003);andFlies etal.,YaleJournalofBiologyandMedicine, 84(4):409-421(2011))〇
[0008] 鑒于上述情況，已經開發出了用于抑制PD-1活性來治療各種類型癌癥w及用于 免疫增強（例如，來治療感染性疾病）的策略（參見，例如，Asciedoetal.，Clin.Cancer. Res.，19巧）：1009-1020 (2013))。在運方面，已經開發了祀向PD-1的單克隆抗體用于治療 癌癥（參見，例如，Weber,Semin.Oncol.,37(5):430-4309(2010);和Tangetal.,Qi;rrent OncologyRepOTts, 15(2) :98-104(2013))。例如，在I期臨床試驗中，nivolumab(也稱 為BMS-936558)在非小細胞肺癌、黑素瘤和腎細胞癌中產生了完全應答或部分應答（參 見，例如，Topalian,New化glandJ.Med. ,366:2443-2454 (2012))，且其目前正處于III期 臨床試驗。MK-3575是針對PD-1的人源化單克隆抗體，其已經在I期臨床試驗中顯示出 抗腫瘤活性的證據（參見，例如，化tnaiketal.,2012Ame;ricanSocietyofClinical Oncology(ASCO)AnnualMeeting,摘要編號2512)。另外，最近的證據表明，祀向PD-1的療 法能增強針對病原體（例如HIV)的免疫應答（參見，例如，化richisetal.，化rr.HIV/ AIDSR巧.，9(1) :81-90 (2012))。盡管有運些進展，然而，運些潛在療法在人體中的效力可 能是有限的。
[0009] 因此，需要W高親和力結合PD-1并且有效地中和PD-1活性的PD-1結合劑（例如， 抗體）。本發明提供了運樣的PD-1結合劑。
[0010] 發明概述
[0011] 本發明提供了一種分離的免疫球蛋白重鏈多膚，其包括SEQIDNO: 1所示的互補 決定區1佑0時氨基酸序列，569 10^:2所示的〔032氨基酸序列，和56〇10^:3所示的 CDR3氨基酸序列，其中任選地，（a)SEQIDN0:1的第9位殘基被不同的氨基酸殘基替換， (b)SEQIDN0:2的第7、8和9位殘基中的一個或多個被不同的氨基酸殘基替換，（c)SEQID N0:3的第1、2和5位殘基中的一個或多個被不同的氨基酸殘基替換，或者（d) (a)至（c)項 的任意組合。
[0012] 本發明提供了一種分離的免疫球蛋白重鏈多膚，其包括SEQIDNO: 12所示的互補 決定區1仰時氨基酸序列，569 10^:13所示的〔032氨基酸序列，和56〇10^:14所示 的CDR3氨基酸序列，其中任選地，（a)SEQIDNO: 12的第9位殘基被不同的氨基酸殘基替 換，（b)SEQIDNO: 13的第8位殘基和/或第9位殘基被不同的氨基酸殘基替換，（c)SEQID NO: 14的第5位殘基被不同的氨基酸殘基替換，或者（d) (a)至（c)項的任意組合。
[0013] 本發明提供了一種分離的免疫球蛋白重鏈多膚，其包括SEQIDNO: 19所示的互補 決定區1佑0時氨基酸序列，569 10^:20所示的〔032氨基酸序列，和56〇10^:21所示 的CDR3氨基酸序列。
[0014] 本發明還提供了一種分離的免疫球蛋白重鏈多膚，其包括與SEQIDN0:4-11、SEQ IDNO: 15-18和沈QIDN0:22-25中的任一具有至少90%同一性的氨基酸序列。
[0015] 本發明提供了一種分離的免疫球蛋白輕鏈多膚，其包括SEQIDN0:26所示的互補 決定區1 (CDR)氨基酸序列和SEQIDN0:27所示的CDR2氨基酸序列。
[0016] 本發明提供了一種分離的免疫球蛋白輕鏈多膚，其包括SEQ ID N0:30所示的互補 決定區l(CDR)氨基酸序列和SEQ ID N0:31所示的CDR2氨基酸序列，其中任選地，SEQ ID NO:30的第12位殘基被不同的氨基酸殘基替換。
[0017] 本發明提供了一種分離的免疫球蛋白輕鏈多膚，其包括SEQIDN0:35所示的互補 決定區1佑0時氨基酸序列，569 10^:36所示的〔032氨基酸序列，和56〇10^:37所示 的CDR3氨基酸序列，其中任選地，（a)SEQIDNO: 36的第5位殘基被不同的氨基酸殘基替 換，和/或化)SEQIDN0:37的第4位殘基被不同的氨基酸殘基替換。
[0018] 本發明提供了一種分離的免疫球蛋白輕鏈多膚，其包括與SEQIDNO:28、SEQID NO:29、沈QIDNO:32、沈QIDNO:33、沈QIDNO:34、沈QIDNO:38、沈QIDNO:39、沈QID N0:40或者SEQIDN0:41具有至少90%同一性的氨基酸序列。
[0019] 此外，本發明提供了編碼前述免疫球蛋白多膚的分離的或純化的核酸序列、包括 運種核酸序列的載體、包括前述免疫球蛋白多膚的分離的PD-1結合劑、編碼運種PD-1結合 劑的核酸序列、包括運種核酸序列的載體、包括運種載體的分離的細胞、包括運種PD-1結 合劑或者運種載體的并且具有藥學上可接受的運載體的組合物、和通過向哺乳動物施用有 效量的運種組合物W在哺乳動物中治療癌癥或者感染性疾病的方法。
[0020] 附圖簡述
[0021] 圖1示意性地描繪了用于生成如實施例1所述的抗PD-1單克隆抗體的不同的 PD-1抗原構建體。 陽02引圖2顯示的實驗結果證實了在存在低水平的抗PD-1抗體APE2058的條件下，在人CD4叮細胞MLR測定法中抗TIM-3的括抗劑抗體升高的活性。
[0023] 圖3顯示的實驗結果證實了在存在低水平的抗PD-1的APE2058的條件下，在人 CD4叮細胞MLR測定法中抗LAG-3的括抗劑抗體升高的活性。
[0024] 發明詳述
[0025] 本發明提供了一種分離的免疫球蛋白重鏈多膚和/或一種分離的免疫球蛋白輕 鏈多膚，或其片段（例如，抗原結合片段）。本文使用的術語"免疫球蛋白"或"抗體"，是指 見于脊椎動物血液或者其他體液中的蛋白，其被免疫系統用來識別和中和外來物體，例如 細菌和病毒。所述多膚是"分離的"，是指其被移除出其天然環境。在優選的實施方案中， 免疫球蛋白或抗體是包括至少一個互補決定區（CDR)的蛋白。所述CDR形成抗體的"高變 區"，其負責抗原結合（在下文中進一步討論）。完整的免疫球蛋白通常由四條多膚組成：兩 條具有相同拷貝數的重化）鏈多膚和兩條具有相同拷貝數的輕（L)鏈多膚。所述重鏈中的 每一條含有一個N-末端可變（Vh)區和Ξ個C-末端恒定（CJ、0)2和0)3)區，并且每條輕 鏈含有一個N-末端可變（\)區和一個C-末端恒定（CJ區。基于其恒定結構域的氨基酸 序列，可將抗體的輕鏈歸入兩種不同類型中的一種，kappa(K)或lambdaa)。在典型的免 疫球蛋白中，每條輕鏈通過二硫鍵連接重鏈，并且所述兩條重鏈通過二硫鍵彼此相互連接。 所述輕鏈可變區與所述重鏈可變區對齊，并且所述輕鏈恒定區與所述重鏈的第一恒定區對 齊。所述重鏈的其余恒定區彼此互相對齊。
[00%] 每對輕鏈和重鏈的可變區形成抗體的抗原結合位點。所述Vh和Vl區具有相同的基 本結構，其中每個區域包括四個框架（FW或FR)區。本文所用的術語"框架區"是指在所述 可變區內的相對保守的氨基酸序列，其中所述框架區位于高變區或者互補決定區（CDR)之 間。每個可變結構域有4個框架區，命名為FR1、FR2、FR3和FR4。所述框架區形成β片層，其 提供所述可變區的結構框架（參見，例如，C.Α.Janewayetal. (eds. ),Immunobiology, 5th Ed.'GarlandPublishing,化wYork,NY(2001))。
[0027] 所述框架區由Ξ個互補決定區（CDR)相連。如上討論，所述Ξ個CDR,即CDRUCDR2 和CDR3,形成抗體的"高變區"，其負責抗原結合。所述CDR形成環，所述環連接，并且在某 些情況下包括部分的，由框架區形成的β-片層結構。盡管所述輕鏈和重鏈的恒定區不直 接參與所述抗體與抗原的結合，但是所述恒定區能影響可變區的方向。所述恒定區還顯示 出各種效應功能，例如通過與效應分子和細胞的相互作用參與抗體依賴的補體介導的裂解 或抗體依賴的細胞毒性。
[0028] 理想地，本發明所述分離的免疫球蛋白重鏈多膚和分離的免疫球蛋白輕鏈多膚結 合PD-1。如上討論，程序性死亡-1 (PD-1)(也稱為程序性細胞死亡1)是具有268個氨基酸 的I型跨膜蛋白（Ishidaetal.，同上）dPD-1是Τ細胞調節物CD28/CTLA-4家族的成員， 并且在活化的T細胞、B細胞和髓系細胞上表達（Greenwaldetal.,同上；and化a巧eet al.，同上）。PD-1包括胞外的IgV結構域，后跟短胞外柄、跨膜區和胞內尾。所述胞內尾包 含位于基于免疫受體酪氨酸抑制基序和基于免疫受體酪氨酸轉換基序中的兩個憐酸化位 點，其在PD-1負調節T細胞受體信號的能力方面發揮作用（參見，例如，Ishidaetal.，同 上；和Blanketal.，同上）。本發明所述分離的免疫球蛋白重鏈多膚和本發明所述分離 的免疫球蛋白輕鏈多膚能形成運樣的試劑：其結合PD-1和另一抗原，產生"雙反應性"的結 合劑（例如，雙反應性抗體）。例如，所述試劑能結合PD-1和免疫系統的另一負調節物如， 例如，淋己細胞激活基因3 (LAG-3)和/或T細胞免疫球蛋白結構域和粘蛋白結構域3蛋白 0?Μ-3)。 W29] 結合PD-1的抗體及其組分在本領域是已知的（參見，例如，美國專利號8, 168, 757;Topalianetal.,同上；和化tnaiketal.,同上）。抗PD-1的抗體也可購自 如，例如，Abeam(Cambridge,MA)等來源。
[0030]氨基酸"替換"或"取代"是指位于給定位置上的一個氨基酸或者殘基被位于相同 位置的另一氨基酸或者位于多膚序列內的殘基替換。
[0031] 氨基酸大致分為"芳香族"或"脂肪族"。芳香族氨基酸包括芳香環。"芳香族"氨 基酸的實例包括組氨酸化或His)、苯丙氨酸（F或化e)、酪氨酸燈或Tyr)和色氨酸（W或 Trp)。非芳香族氨基酸大致歸為"脂肪族"。"脂肪族"氨基酸的實例包括甘氨酸（G或Gly)、 丙氨酸（A或Ala)、鄉氨酸（V或Val)、亮氨酸化或Leu)、異亮氨酸（I或lie)、甲硫氨酸 (M或Met)、絲氨酸（S或Ser)、蘇氨酸燈或化r)、半脫氨酸（C或切S)、脯氨酸（P或Pro)、 谷氨酸巧或Glu)、天冬氨酸（A或Asp)、天冬酷胺（N或Asn)、谷氨酷胺怕或Gin)、賴氨酸 化或Lys)和精氨酸巧或Arg)。
[0032] 脂肪族氨基酸可W再分為四個亞組。"大脂肪族非極性亞組"由鄉氨酸、亮氨酸和 異亮氨酸組成。"脂肪族微極性亞組"由甲硫氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和半脫氨酸組成。"脂肪 族極性/帶電亞組"由谷氨酸、天冬氨酸、天冬酷胺、谷氨酷胺、賴氨酸和精氨酸組成。"小殘 基亞組"由甘氨酸和丙氨酸組成。帶電/極性氨基酸組可W再分為Ξ個亞組：由賴氨酸和 精氨酸組成的"帶正電亞組"、由谷氨酸和天冬氨酸組成的"帶負電亞組"、W及由天冬酷胺 和谷氨酷胺組成的"極性亞組"。
[0033] 芳香族氨基酸可W再分為兩個亞組：由組氨酸和色氨酸組成的"氮環亞組"和由苯 丙氨酸和酪氨酸組成的"苯基亞組"。
[0034] 氨基酸替換或取代可W是保守的、半保守的、或者不保守的。短語"保守的氨基酸 取代"或者"保守的突變"是指一個氨基酸被另一具有共同特性的氨基酸替換。一種明確個 體氨基酸之間共同特性的功能性方法是分析同源生物相應蛋白之間氨基酸變化的基準化 步頁率（SchulzandSchirmer,PrinciplesofProteinStructure,Springer-Verlag,New York(1979))。根據運種分析，可W定義氨基酸的組別，其中組內的氨基酸優先與彼此交換， 并且因此在其對蛋白質總體結構的影響上彼此最為相似（SchulzandSchirmer,同上）。
[0035] 保守的氨基酸取代的實例包括上述亞組內的氨基酸的取代，例如，賴氨酸取代精 氨酸，反之亦然，使得可W保留正電荷；谷氨酸取代天冬氨酸，反之亦然，使得可W保留負電 荷；絲氨酸取代蘇氨酸，使得可W保留游離的-〇H;W及谷氨酷胺取代天冬酷胺，使得可W 保留游離的-畑2。
[0036] "半保守突變"包括上面列出的相同組、而非相同亞組中氨基酸的氨基酸取代。例 如，天冬氨酸對天冬酷胺的取代，或者天冬酷胺對賴氨酸的取代，設及同組內但在不同亞組 內的氨基酸。"不保守突變"設及不同組間的氨基酸取代，例如，賴氨酸取代色氨酸，或者苯 丙氨酸取代絲氨酸等。
[0037] 本發明提供了一種免疫球蛋白重鏈多膚，其包括SEQIDNO: 1所示的互補決定區 1 (CDR)氨基酸序列，SEQIDNO: 2所示的CDR2氨基酸序列，和SEQIDNO: 3所示的CDR3氨 基酸序列。在本發