一種柯薩奇病毒ca10型熒光定量pcr檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及核酸巧光PCR檢測試劑盒，尤其設及薩奇病毒CA10型巧光定量PCR檢 測試劑盒，屬于手足口病的體外診斷領域。
【背景技術】
[0002] 手足口病化and.化ot-mouthdisease)是世界范圍內流行的兒童常見病，主要發 生于3歲W下兒童，但偶有成人發病的報告，是由多種腸道病毒引起的，W發熱和手、足、口 腔等部位出現瘤疹為主要特征的疾病，少數患病兒童可出現腦炎，急性弛緩性麻搏，屯、肌 炎，腦水腫等嚴重并發癥，病情進展快，嚴重者可導致死亡。近些年來，手足口病在許多國 家，特別是亞太地區發生過多次的爆發或流行，越來越受到各國的關注。引起手足口病的病 原體多樣，但都為單股正鏈RNA病毒，屬于小RNA病毒科的腸道病毒。到目前為止，有文獻 報道的20多個血清型可引起手足口病，主要有CA16、CA6、CA7、CA9、CA10、CB2、CB5、CB13、 ECH019W及EV71 型等。
[0003] 在日本和中國臺灣，CA10與瘤疹性咽峽炎的爆發相關，部分感染CA10病人出現神 經系統癥狀，最近新加坡的報告指出，CA10和CA6在引起手足口病中的病原中與CA16和 EV71同等重要。2007-2008年，山東地區分離的330例HFM病毒株中有17例為CA10型。 2013年西安地區共報告手足口病臨床診斷病例16964例中，柯薩奇病毒A6型（CA6)陽性 率為51. 12%，柯薩奇病毒A16型（CA16)陽性率為22. 1%，腸道病毒71型巧V71)陽性率 為11. 2%，柯薩奇病毒A10型（CA10)陽性率為4. 4%，其它腸道病毒陽性率為11.2%。在 2013年夏天，中國長春市爆發了手足口病，總共有1125例病人確診為手足口病患者，大部 分均為5歲W下，總共220份手足口病樣本被收集并進行檢測，有101份化6. 9% )為CA6 感染，其他感染的腸道病毒包括CA2(1.3% )，CA10(1.9% )，CA14(0.6% )，CA16巧.9% )， CB4(1.3% )，EV71(19. 2% )和EC30(0.6% )。
[0004] 柯薩奇病毒CAIO型與其他柯薩奇病毒一樣，屬于小RNA病毒科，腸道病毒屬 巧nterovirus)，致病譜廣，是多種人類疾病的致病原。CA10病毒現在已經成為引起兒童 HFMD的主要病原之一。CA10病毒顆粒為二十面體對稱球形，由核酸和蛋白質組成，無包膜 和突起。病毒顆粒核屯、含一開放閱讀框架，編碼的多聚蛋白經過自身蛋白酶水解，分為P1、 P2和Ρ3Ξ種前體蛋白。P1區前體蛋白又可編碼病毒的結構蛋白P1~VP4,組成病毒衣殼。 目前常用的診斷方法為：病毒分離方法、血清學方法、PCR方法。 陽0化]其中，病毒分離方法利用組織培養、分離腸道病毒是目前診斷手足口病病原的金 標準，但是由于任何一種細胞都不可能對引起手足口病所有腸道病毒進行培養，所W，雖 然病毒培養技術是檢測診斷腸道病毒的金標準，但此方法操作繁瑣，分離率不高，在手 足口病的流行爆發期間，難W推廣應用；血清學方法最常用的方法是酶聯免疫吸附實驗 巧LISA)，運種方法可W對單份血清或急性期和恢復期的雙份血清進行檢測，簡單、快速，不 需要特別的儀器，非常適合基層醫療單位，但由于腸道病毒共同抗原表位的存在，所W均有 不同程度的交叉反應性；PCR(polymerasechain化ction，聚合酶鏈式反應），是一種分子 生物學技術，用于放大擴增特定的DM片段，可看作生物體外的特殊DM復制，即使采集的 標本中含有微量的病毒RNA或是失活病毒，也能經過PCR擴增后檢測出來。與病毒分離W 及血清學檢測相比，RT-PCR具有特異、簡單、快速、敏感等優點，并且，擴增產物可W通過測 序之后用于分子流行病學分析。但是PCR也存在許多不足之處，PCR消耗試劑大、操作步驟 多、容易造成PCR污染，并且，PCR-次性檢測的樣本數有限，大規模檢測時耗時耗力。
[0006] 結合國內情況，在臨床HFM診斷中，實時巧光PCR技術憑借著快速、敏感、特異等 優點顯示出了其臨床診斷的優越性，目前只有極少量巧光PCR診斷試劑盒在CA6診斷中使 用，但是缺乏完善的質控體系，操作比較繁瑣，靈敏度不高，還需要進一步完善和提高技術 水平，使此類產品更加滿足臨床準確快速診斷的需要。 陽007] 臨床上檢測CA10-RNA的方法目前主要是基于實時巧光定量PCR的技術及其改進， 實時巧光定量PCR技術是近年來發展迅速的一種核酸檢測技術，使用一種帶有巧光檢測裝 置的PCR擴增儀，巧光檢測裝置能夠按照一定的程序周期性地發出特定波長的激發光，收 集檢測巧光信號，通過檢測巧光信號的動態變化實時反映PCR的每個循環的擴增水平，試 驗結束后可通過軟件自動分析獲得擴增曲線，根據擴增曲線與巧光闊值線的交點（即Ct 值）W及擴增曲線的形狀，可W判斷陰陽性結果；如果同一反應中有已知濃度的定量參考 品或標準品，則可W通過軟件自動分析獲得標準曲線，由此實現對未知樣本的定值（即定 量檢測）。與傳統的PCR相對比，其在反應體系中增加了一條兩端分別標記巧光報告基團和 澤滅基團的探針。探針結構完整時，巧光報告基團發出的巧光能量被澤滅基團吸收，呈現澤 滅效應；如果擴增過程中有祀序列的存在，隨著目標片段的延伸，探針分子逐漸被Taq酶水 解切斷，巧光報告基團與澤滅基團相互解離，阻斷了二者間巧光能量轉移效應，巧光報告基 團發出的巧光信號被巧光檢測裝置收集。隨著擴增的進行，巧光信號隨著目的片段的擴增 而呈現線性增強。試驗結束后，可W通過巧光PCR儀自帶的軟件自動分析數據，可W獲得陰 陽性結果和樣本濃度的定值結果，因此，該技術在祀多核巧酸樣品的檢測和定量分析中，已 逐漸取代傳統的PCR方法，得到十分廣泛的應用。
[0008] 國內已有多種基于實時巧光定量PCR技術定量檢測柯薩奇病毒CA10型的方法，運 些試劑盒所提供的CA10-RNA提取方法主要是Trizol法和柱提取法，但是，有W下不足之 處：（1)Trizol法雖然是最經典的RNA提取方法，但是操作繁瑣，對于設備和人員操作要求 高，低病毒載量的標本檢出率低，且所用試劑具有一定的毒性；柱提取方法雖然無需高速離 屯、，但是需頻繁更換離屯、管，用時長，特異性較差；（2)無法有效去除樣本中的PCR抑制物； (3)沒有設置陽性內對照（即內標），無法監控假陰性；(4) 一般沒有預防PCR產物污染的 措施；（5)現有方法檢測靈敏度欠佳，可能出現漏檢現象。
【發明內容】
[0009] 本發明的目的在于解決現有柯薩奇病毒CA10型核酸巧光定量PCR檢測試劑盒 的缺陷，提供一種具有操作快速、方法簡便、檢測靈敏度高、檢測范圍寬而準確柯薩奇病毒 CA10型核酸巧光定量PCR檢測試劑盒，可W對人血清或咽拭子或瘤疹滲出液等標本中的柯 薩奇病毒CA10型進行定量分析，檢測結果可用于柯薩奇病毒CA10型感染的輔助診斷和疾 病監控。
[0010] 本發明實施例中提供了一種柯薩奇病毒CA10型巧光定量PCR檢測試劑盒，其包括 W下各組分：RNA提取溶液、RNA洗脫液、RT-PCR增強劑、內標、PCR反應液、CAIO陽性對照 品、CA10陰性對照品，其中，所述內標為插入PUC18T載體的一段長為128堿基對的人工合 成DNA序列的重組體，濃度為1. 00E+04copies/ml~5. 00E+04copies/ml;128堿基對的序 列如下所示：
[0011] 5'-GTCCAGTACTTTCAAAGCTCGATCCCGGTAACTACCAAATCGGTACGTACCGGTTTAAAACCACCG ATCGCCTCTTCCCAACCTGTACGTACGTACGTACGTCCAAAAGTTTCCACGTACGATCGATC-3' 〇
[0012] 優選的，上述檢測試劑盒，其中，所述RNA提取溶液包括如下組分： 陽01引 RNA提取溶液I:十二烷基硫酸鋼，質量/體積0. 2 %~1. 0 %、曲拉通，體積/體積 1. 0%~4. 0%，異硫氯酸脈 0. 2mol/L~1.Omol/L、100μg/ml~400μg/ml的磁珠；
[0014] RNA提取溶液II:4-徑乙基贓嗦乙橫酸lOOmmol/L~300mmol/l、抑6. 5 + 0. 2,氯 化鋼lOOmmol/L~300mmol/L；
[0015] RNA提取溶液III:曲拉通，體積/體積0. 1 %~1. 0 %、氯化鋼lOOmmol/L~ 300mmol/L；
[0016] RNA提取溶液IV:礦物油。
[0017] 優選的，上述檢測試劑盒，其中，所述RNA洗脫液為Tris-肥1 0.8