一種與芝麻籽粒種皮色基因緊密連鎖的snp分子標記的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子遺傳育種技術領域，具體設及一種與芝麻巧粒種皮色基因緊密連 鎖的SNP分子標記&'SCC2385。
【背景技術】
[0002] 芝麻（歴ini/ic細？L.，2n=26)，屬胡麻科胡麻屬，是世界上最古老的特色優 質油料作物之一。我國是芝麻四大主產國之一，年種植面積1200萬畝左右，總產量約75萬 噸。根據種皮顏色，芝麻又被分為白芝麻和黑芝麻。在我國，白芝麻主產區主要分布于河南、 安徽和湖北Ξ省，黑芝麻主產區主要位于江西省。因顏色純正，外觀及內在品質優良，我國 白芝麻和黑芝麻生產均在國際芝麻生產和貿易中享有盛譽。
[0003] 芝麻種皮顏色是芝麻重要的農藝性狀之一。在自然界中，芝麻巧粒顏色多樣，如 白色、黃色、褐色、灰色、黑色等。通常情況下，白芝麻巧粒中的油分、蛋白及水分含量等均 比黑芝麻的要高，而礦物質和碳水化合物含量卻低于黑芝麻（Kanu，2011)。此外，芝麻 種皮顏色還與種子中抗氧化物質的活性、含量W及芝麻的抗性水平有關（Budowskiand Markley,Thechemicalandphysiologicalpropertiesofsesameoil,1951,ChemRev, 48 (1): 125 - 151 ;Nakimi，Thechemistryandphysiologicalfunctionsofsesame， 1995,FoodRevInt11 (2): 281 - 329 ;Kanu，Biochemicalanalysisofblackandwhite SesameseedsfromChina,2011,AmJBiochemMolBiol1: 145 - 157;Shahidietal., Antioxidantactivityofwhiteandblacksesameseedsandtheirhullfractions, 2006，FoodQiem99: 478 - 483 ;E1-Bramawyetal.，Assessingthesuit油ilityof morphologicalandphenologicaltraitstoscreenSesamegenotypesforFusarium wiltandcharcoalrotdiseaseresistance，2008,JPlantProtectRes48: 397 -410; Zhangetal.，AnalysisofSesamekaryotypeandresemblance-nearcoefficient，2012 ，ChinBullBot. 47 化）：602 - 614)。
[0004] 研究表明，芝麻種皮顏色與芝麻物種進化有一定的關系。芝麻物種的進化方向應 為野生一黑色一褐色一黃一白色的進化趨勢（何鳳發等，1994，西南農業大學學報，芝 麻的核型與系統演化；張海洋等，2012,植物學報，芝麻染色體核型及似近系數分析)。芝 麻種皮色性狀為數量性狀，受兩對加性-顯性-上位性主基因W及多基因控制（Zhang etal.，2013，PLoSONE,GeneticanalysisandQTLmappingofseedcoatcolor insesame(SesamuminciumL.);BaydarandTurgut, 2000，Studiesongenetics andbreedingofsesame(SesamumindicumL.)I.Inheritanceofthecharacters determining化eplanttype.TurkishJournalofBiology)。2013 年，我國芝麻科研 人員采用RGB顏色模型，分析了種皮色性狀在黑、白芝麻六世代群體中的遺傳變化，并利用 遺傳圖譜確定了 4個與芝麻種皮顏色緊密連鎖的QTL(Zhangetal.，2013，PLoSONE， GeneticanalysisandQTLmappingofseedcoatcolorinsesame(Sesamumincium L.) )D該研究為進一步推動芝麻分子輔助育種技術的發展奠定了基礎。
[0005] 但是，由于芝麻巧粒種皮顏色多樣，性狀研究易受巧粒發育、成熟度等影響，芝麻 巧粒種皮色基因相關研究仍有待深入。
【發明內容】
[0006] 本發明的主要目的是提供一種與芝麻巧粒種皮色基因緊密連鎖的SNP分子標記 &'SCC2385,同時提供了一種利用PCR技術檢測該分子標記的檢測方法，通過檢測該分子標 記，從而對種皮顏色做出預判，從而為芝麻新品種培育提供參考。
[0007] 本發明所采取的詳細技術方案如下。
[0008] -種與芝麻巧粒種皮色基因緊密連鎖的SNP分子標記&'SCC2385,該標記在芝麻 SNP遺傳圖譜中位于第9連鎖群，195. 48-197. 79cM，對種皮色的解釋率為87. 5%~90% (Vg/ 化），該標記包含103bp，其序列如SEQIDNo. 1所示，具體為： GCTCTCTCTACACACCTCTCTGTTTTATTCTGTTCTTTGCATTTTTGGTGGGTTTTTTTTTGCCGTTTTCCTC AACATACACGATAGCCCACTGTGTTTTTTC。
[0009] 需要說明的是，上述SNP位點序列中第25個堿基T，當T變為C時，芝麻種皮色往 往發生顯著變化，多表現為由淺色（白色）變為深色(黑色）； 換言之，本申請&'SCC2385等位位點序列為： GCTCTCTCTACACACCTCTCTGTTCTATTCTGTTCTTTGCATTTTTGGTGGGTTTTTTTTTGCCGTTTTCCTC AACATACACGATAGCCCACTGTGTTTTTTC。
[0010] 所述SNP分子標記&'SCC2385在芝麻新品種培育中的應用，包括W下步驟： (1) 提取待測芝麻種質資源的基因組DNA; (2) 利用Primerpremier5. 0軟件設計引物對，引物設計時，需要注意的是，為區分被 檢測基因組DNA中不同SNP等位位點，研究人員通常需要完成W下2方面工作： 第一，將SNP引物對設計成3條，并需在特異引物的3'末端第3位的堿基引入錯配W增加擴增產物的特異性；引入錯配的原則為：引物3'端-3位錯配堿基與3'末端的SNP錯 配堿基形成穩定性互補的錯配結構；即強錯配型（C/T或G/A)與弱錯配型（C/A或 G/T)搭配，中等錯配型（A/A、C/C、G/G或T/T)與中等錯配型搭配； 第二，在含有SNP位點的2個正向或反向引物中，將其中1條引物序列的5'端隨機增 加5個堿基，其主要目的是為了不同位點的PCR產物在后續凝膠電泳圖譜區分能夠較為便 捷地區分開來； 具體引物序列設計如下： 正向引物 1F序列為：5'GCTCTCTCTACACACCTCTCTGGTT3' ； 正向引物 2F序列為：5'TATAAGCTCTCTCTACACACCTCTCTGGTC3' ； 反向引物R序列為：5'GAAAAAACACAGTGGGCTATCGT3' W步驟（1)中所提取DNA為模板，進行PCR擴增； 在用正向引物1F、反向引物R進行芝麻基因組DNA擴增時，PCR擴增產物大小為103bp; 在用正向引物2F、反向引物R擴增時，PCR產物大小為108bp; (3) 對步驟（2)中PCR擴增產物進行凝膠電泳，判斷待測芝麻種質資源的基因組DM中 所含的SNP分子標記5?5(Χ2385中第25個堿基是T或C; 如果為C堿基，則表明待測芝麻材料基因組中含有與芝麻深色種皮性狀緊密連鎖的分 子標記，則其后代種皮色為深色或黑色的可能性極大，可用于培育非白粒芝麻新品種； 反之，如果含有T堿基，則該芝麻材料含有與芝麻淺色種皮性狀緊密連鎖的分子標記， 則其后代種皮為淺色或白色的可能性極大，可W用于選育白芝麻新品種。
[0011] 總體而言，本發明創新點主要體現在W下幾個方面： (1) 本發明通過對黑、白種皮色芝麻種質的遺傳圖譜構建、Q化定位W及自然群體間的 關聯驗證，提供了一種與芝麻巧粒種皮色基因緊密連鎖的SNP標記&'SCC2385,同時提供了 一種鑒定芝麻種質資源中是否含有控制芝麻種皮深淺顏色標記位點的PCR鑒定方法，該方 法可W較為便捷和快速地初步預測待測芝麻品種的種皮色，為新品種培育提供參考； (2) 本發明所獲得的種皮色基因緊密關聯標記位點明確，檢測結果穩定；由于本發 明所提供的標記&'SCC2385篩選時所用的親本之一是芝麻育種中常用的優異親本，與我 國大部分芝麻品種和現有常用芝麻育種親本均有直接或間接親緣關系，因而該標記位點 &'SCC2385具有較好地應用基礎； (3) 本發明所提供的芝麻巧粒種皮色基因緊密連鎖的SNP標記的檢測方法，技術成熟， 檢測結果穩定性好，對提高芝麻遺傳育種工作效率、提升我國芝麻遺傳育種研究技術水平 具有重要意義。
[0012] 與現有芝麻育種方法相比，本發明優點可W概括為：（1)本發明針對芝麻育種技 術進行創新，與目前應用的常規育種技術方法相比，檢測方法簡單高效，結果可靠；（2)本 發明所提供分子標記&'SCC2385,用于芝麻分子輔助育種時可W顯著提高育種效率，節約科 研成本和時間，并為完善芝麻分子育種技術平臺奠定堅實基礎。
【附圖說明】
[0013] 圖1為本發明利用F2群體建立的芝麻SNP高密度遺傳圖譜； 圖2為本發明的遺傳圖譜F2部分群體(含親本）種皮顏色的L值測定結果； 圖3為本發明的遺傳圖譜F2部分群體(含親本）種皮顏色的A值測定結果； 圖4為本發明的遺傳圖譜F2部分群體(含親本）種皮顏色的B值測定結果； 圖5為本發明的L值在芝麻SNP遺傳圖譜中的定位結果； 圖6為本發明的A值在芝麻SNP遺傳圖譜中的定位結果； 圖7為本發明的B值在芝麻SNP遺傳圖譜中的定位結果； 圖8為本發明的SNP標記 5?5(Χ2