一種半滑舌鰨性染色體連鎖的dna片段及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于水產生物技術中的魚類遺傳性別鑒定和性別控制技術領域，具體設及 一種半滑舌錦性染色體連鎖的DNA片段及其在快速鑒定半滑舌錦遺傳性別中的應用。
【背景技術】 陽00引半滑舌錦（切noglossussemilaevis)俗稱"錦米，，、"錦目"，屬于蝶形目、舌錦科、 舌錦屬，是一種近海溫水大型底棲魚類，在我國從勸海到南海都有分布，其中W勸海最多， 黃海次之（柳學周等2005 ;孟慶聞等1995)。半滑舌錦肉質細嫩鮮美、營養價值高，日漸為 人們所喜；且營養級低、食性溫和，活動范圍小、便于工廠化養殖和管理，具有廣闊的養殖前 景，近年來已成為我國北方沿海地區一種優良的增養殖對象（柳學周等2005)。
[0003] 半滑舌錦具有20對常染色體和一對性染色體狂和W染色體），其性別決定機制 為ZW型，遺傳雌魚為異型染色體ZW，遺傳雄魚為同型染色體ZZ(周麗青等，2005)。在自然 條件下，雄性半滑舌錦產生Z型精子，雌性半滑舌錦產生Z、W型兩種卵子，受精后得到正常 的ZZ雄性和ZW雌性后代。在養殖過程中，半滑舌錦雌性個體生長速度明顯大于雄性，研究 發現在21月齡時雌性個體重量可W達到雄性個體的3. 29倍（陳松林等2013)。在自然養 殖條件下有些遺傳雌性半滑舌錦表現為生理雄性，稱為偽雄魚，研究表明偽雄魚的后代中 偽雄魚個體比例更高（Shaoetal.，2014 ;季相山等2010)。養殖群體中高比例的生理雄性 (正常雄魚和偽雄魚）會降低半滑舌錦產量，因此，在半滑舌錦親魚的選育過程中需要剔除 偽雄魚。開發半滑舌錦性別特異分子標記，建立快速鑒定遺傳性別的方法，是進行半滑舌錦 性別控制和提高養殖群體中雌性比例的有效途徑，對實現半滑舌錦養殖業的可持續發展有 重要意義。
[0004] 在半滑舌錦性別特異分子標記的開發和遺傳性別鑒定方面，黃海水產研究所已經 先后篩選到半滑舌錦雌性特異的AFLP標記（化enetal. ,2007)和性別特異的微衛星標記 (化enetal.，2012)。但是在實際應用中，運兩種標記都有自身的不足。AFLP標記由于其 顯性的遺傳特性，在實際鑒定中有可能會出現假陰性，從而對ZZ雄性和ZW雌性產生誤判。 共顯性的微衛星性別特異標記雖然可W準確鑒定ZZ雄性和ZW雌性個體，但由于其兩條DNA 片段條帶之間僅有12bp的差異，無法用瓊脂糖凝膠電泳分辨，只能通過分辨力更高的聚丙 締酷胺凝膠（PAGE膠）電泳的方法進行鑒別，而PAGE膠電泳的操作難度大、操作時間長、對 實驗設備和試劑等要求高，增加了遺傳性別鑒定的時間、提高了成本，難W在半滑舌錦養殖 場進行現場檢測。因此，半滑舌錦性別控制研究和高雌性苗種生產還需要一種能采用瓊脂 糖凝膠電泳方法準確分辨、且可W在養殖場現場應用的遺傳性別快速鑒定的分子技術。
【發明內容】
陽0化]本發明提供了一種半滑舌錦性染色體連鎖的DNA片段及其應用，即一種半滑舌錦 性染色體連鎖的DNA片段并應用到半滑舌錦遺傳性別鑒定W及偽雄魚篩選中。
[0006] 本發明首先通過生物信息學方法分析半滑舌錦全基因組序列，提供了兩條半滑舌 錦Z、W染色體同源差異DM片段，其中Z染色體上DM片段長36化p，命名為SE化虹Z，其序 列為：
[0008] W染色體上DNA片段長度為253bp，命名為沈化虹W，其序列為：
[0010] 上述的DNA片段用于設計鑒定半滑舌錦遺傳性別的分子標記；
[0011] 本發明還基于運兩條DNA片段序列設計了一對性染色體連鎖的DNA片段引物，可 W通過普通濃度（1.5%)的瓊脂糖凝膠電泳清晰分Z、W染色體特異DNA片段，準確鑒定半 滑舌錦遺傳性別，上、下游引物序列分別為：
[0012] SEQZW:1 :5' -GTCACAGTTCCAACCAGGACAAGAG-3'(沈Q ID N0:3);
[0013]沈Q ZW:2:5' -CCTGTTGTTGTTCTACTAAGTCTG-3'(沈Q ID N0:4);
[0014] 使用上述的引物來鑒定半滑舌錦遺傳性別，主要包括W下步驟：
[0015] 半滑舌錦基因組DNA的提取、Z、W同源差異DNA片段PCR擴增、PCR產物瓊脂糖凝 膠電泳檢測步驟；其中在遺傳雄性個體中擴增出36化P的單一DNA片段；在遺傳雌性個體 中擴增出366bp和253bp的兩種DNA片段。
[0016] 本發明從半滑舌錦全基因組信息中篩選到兩條Z、W染色體同源差異DNA片段，設 計引物進行半滑舌錦遺傳性別鑒定，可W快速、準確、有效的區分半滑舌錦遺傳性別。該方 法在雌、雄個體中都可擴增出特異目的條帶并可W用瓊脂糖電泳分辨，縮短了準確鑒定半 滑舌錦遺傳性別的時間，適用于養殖場簡易環境內半滑舌錦遺傳性別的鑒定，節約了檢測 時間和成本。本發明所示檢測半滑舌錦遺傳性別的方法，可用于對偽雄魚的鑒定和篩選，對 提高養殖群體雌性比例，推動半滑舌錦養殖業持續健康發展具有重要意義。
【附圖說明】
[0017] 圖1 :本發明Z、W染色體DNA片段序列比對圖，引物位置用下劃線表示誼格：Z、W 染色體DM片段差異序列；* :Z、W染色體DM片段一致序列；-:缺失序列
[001引圖2:本發明遺傳雌、雄半滑舌錦PCR產物1. 5%瓊脂糖凝膠電泳結果圖，畢：遺傳 雌魚；?:遺傳雄魚；Μ :DL 2000DNA Maker;
【具體實施方式】
[0019] 下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步詳細的說明。
[0020] 實施例1半滑舌錦性染色體連鎖DNA片段的篩選
[0021] 本發明所用的性染色體連鎖的DM片段序列來源于中國水產科學研究院黃海水 產研究所水產基因組與細胞工程研究室完成的半滑舌錦全基因組測序結果，生物信息學分 析半滑舌錦基因組序列篩選出兩條Z、W染色體同源差異DNA片段。設計多對引物，篩選出 了結果穩定的一對引物（SEQZW:1、SEQZW:2)。 陽02引選擇已知遺傳性別的雌、雄半滑舌錦DNA，使用引物SEQZW: 1、SEQZW:2進行PCR擴增，反應條件及程序如下：PCR反應體系包括35. 5μLd地20點0μL10XBuffer;4. 0μL dNTP(2. 5mmol/L) ;1.0μΙ沈QZW:l(10