微滴數字PCR（ddPCR）檢測土壤中TCK冬孢子的方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及微滴數字PCR(ddPCR)檢測±壤中TCK冬抱子的方法，屬于小麥矮腥黑 粉菌防治領域。
【背景技術】
[0002] 小麥矮腥黑穗病是由小麥矮腥黑粉菌（Tilletiacontroversa肺hn，TCK)引起的 重要國際檢疫性病害，也是我國對外檢疫的一類危險性植物病害。該病害危害大、防治難， 一旦傳入會給小麥生產帶來毀滅性危害，通常發病率約等于小麥產量損失率。據化ffmann 報告，在流行年份，因TCK引起的損失率一般為20%~50%，最高可達75%~90%。除了 產量損失外，被侵染的小麥出粉率也會隨著感染嚴重程度而降低，并且因含有TCK冬抱子 而極大地影響品質。TCK的寄主范圍很廣，危害小麥、大麥、黑麥等禾本科18個屬的70多種 植物，其中，對小麥危害最嚴重。小麥矮腥黑粉菌對我國的小麥生產存在潛在危機，該病在 栽培條件下的主要寄主為冬小麥，我國常年小麥種植面積約2300萬hm2,其中冬小麥占絕 大部分，西北、黃淮海等廣大冬麥區均適合小麥矮腥黑粉菌的定殖和發生危害，隨著我國加 入WT0及與TCK疫區國家-美國小麥貿易的增加，TCK傳入我國的可能性日益增大，因此， 必須加強小麥矮腥黑穗病的早期預警及檢疫檢測，為病害防治提供技術儲備。冬季小麥矮 腥黑粉菌冬抱子潛藏在±壤中，定性定量檢測±壤中小麥矮腥黑粉菌冬抱子的含量，對于 早期預警和預防病害，具有重要的意義。
[0003] 聚合酶鏈式反應（polymerasechainreaction,PCR)是分析檢測樣品中核酸分子 最常用的方法。目前，應用最多、靈敏度最高的核酸定量技術是實時巧光定量聚合酶鏈式 反應，其準確度可達95%，檢測時將未知的目標核酸分子和已知標準樣品同時進行擴增，根 據加入的巧光分子探針信號實時觀察模板的擴增情況，檢測結果W線性的擴增信號形式輸 出，根據已知標準樣品的擴增曲線來推算未知樣品的起始模板拷貝量。因此，巧光定量PCR 技術是一種相對的核酸定量方法，其靈敏度和準確度均受到限制。qRT-PCR在分析外源基 因拷貝數時必須依賴于標準曲線和已知拷貝數的基因，只是一種相對定量方法，且標準曲 線的質量易受到DNA純度、引物和探針的濃度、反應抑制因子等諸多因素影響（Cankaret al.，2006);另外，標準曲線必須基于標準物質建立，而標準物質的種類有限和昂貴價格不 能適用于所有的研究。并且，小麥矮腥黑粉菌抱子體積質量都非常小，而±壤中微生物種類 多，TCK的DNA在±壤樣品總DNA中的比例極低，有必要采用靈敏度更高的方法進行定量分 析。
[0004]數字PCR(化opletdigitalPCR，ddPCR)是近10年興起的第Ξ代PCR技術。通 過極度稀釋實現理論上的單分子擴增，然后用終點法PCR和泊松分布計算出樣品的原始濃 度。斯洛文尼亞科研人員利用微滴ddPCR(化opletdigitalPCR，ddPCR)檢測轉基因玉米 M0N810的外源基因含量，從而開啟了新一代PCR技術檢測轉基因食品的先河。ddPCR將預 混合的PCR反應體系隨機分散到數千萬個微滴中形成油包水的結構，保證每個微滴中僅含 有一個或不含有模板分子。每個微滴在各自的反應體系中進行PCR擴增，擴增的產物通過 之前添加的探針發出巧光信號從而實現定量目的。由于微滴中模板的存在情況滿足泊松分 布，根據發出巧光信號的數目代入泊松分布公式計算即可得出樣品的定量結果。而且，該方 法無需依賴外部核酸標準，因此可實現對核酸分子的絕對定量分析；其定性和定量檢測限 比傳統定量PCR低，能分別達到5個和6個拷貝數，比定量PCR靈敏度高1000-10000,其他 方面如特異性和重復性較之于傳統定量PCR也存在極大的優勢。鑒于運種微滴反應能極大 程度分散反應體系，它可W有效消除抑制因子的作用，保證檢測過程中的擴增效率，對檢測 低含量目標核酸分子的樣品有良好的效果。
【發明內容】
[0005] 根據上述領域存在的不足和需求，本發明提供一種微滴數字PCR檢測±壤中TCK 冬抱子的方法，能夠對±壤中的小麥矮腥黑粉菌進行絕對定量，有利于及時采取防治措施， 防止小麥矮腥黑穗病的發生。
[0006] 本發明要求保護的技術方案如下：
[0007] 微滴數字PCR檢測±壤中小麥矮腥黑粉菌的方法，其特征在于，包含如下步驟：
[000引 （1)提取待測上壤樣品的總DNA;
[0009] (2)W待測±壤樣品的總DNA為模板進行微滴數字PCR反應，得到PCR產物；
[0010] (3)將PCR產物放入微滴讀取儀中讀取信號，分析實驗數據，獲得±壤樣品中小麥 矮腥黑粉菌的絕對含量，
[0011] 其特征在于，±壤中小麥矮腥黑粉菌的總DNA提取方法如下：
[0012] 將取回的±壤樣品過網篩除去雜質；然后冷凍；
[001引采用FastDNA?SPINKitforSoil試劑盒提取±壤樣品的總DNA，步驟如下：
[0014] (1)稱取500mg±壤加到Lysing MatrixETube中；
[0015] (2)力日 978ulsodiumPhosphateBuffer到管中；
[001引 做加12化1MTBuffer;采用細胞震蕩破碎儀w6. 5M/S震蕩2分鐘對±壤樣品 進行處理；
[0017] (4) 14000r/min離屯、10 分鐘；
[0018] (5)將上清液轉移到一個2ml管，加入250ulPPS，混合均勻；
[0019] (6) 1400化/min離屯、5分鐘，將上清液轉移到一個新的2ml管；
[0020] (7)加入 1ml充分混勻的Binding Matrix ;
[0021] 做滿旋2分鐘，讓DM充分結合基質，滿旋后將管放到管架上靜置3分鐘；
[00過 （9)去除500ul上清液，避免碰到沉淀；
[0023] (10)重懸試管讓BindingMatrix重新混勻，取約600ul的混合液轉移到Spin Filter中，14000r/min離屯、1分鐘，倒空流出液，再把剩下的上清液加入SpinFilter中， 140(K)r/min離屯、1分鐘，倒出流出液；
[0024] (11)加500ul的已加入無水乙醇的沈WS-M到SpinFilter中，利用水流重懸里面 的固體；
[002引 （12) 14000r/min離屯、1分鐘，倒出流出液；
[0026] (13) 14000r/min空離2分鐘，W清空SpinFilter中剩余的沈WS-M液體；
[0027] (14)移動SpinFilter到新的化1:油Tube中，放置于室溫下風干5分鐘；
[002引 （15)加入50ul的DES，用槍頭輕輕攬動濾膜，將樣品放到55度水浴鍋中加熱5分 鐘；
[0029] (16)取出樣品后，14000r/min離屯、1 分鐘，棄掉SpinFilter,將CatchTube中的 DM放置于4度冰箱備用。
[0030]所述微滴數字PCR反應的體系為：10μL ddPCR Supermix for Probes,10μL/mol 正向引物和反向引物各1.8化，探針0.6化，DM模板2.0化，(1地2〇 3.8化。
[0031] 所述正、反向引物及探針引物的核巧酸序列為：
[0032]正向引物：5 ' -ACGACCGACTTTCCGAGAGC-3，，
[0033]反向引物：5，-GTGTGGGACGAAGGCATCAA-3，，
[0034]探針引物：FAM5, -ACGACTTGCGGTCCCTCCACA-3,TAMAR。
[0035] 所述微滴數字PCR反應的程序為：95°C預變性10分鐘，1個循環；94°C變性15秒， 58°C退火30秒，72°C延伸30秒，10個循環；94°C變性15秒，60°C退火30秒，72°C延伸30 秒，30個循環。
[0036] 小麥矮腥黑粉菌抱子體積質量都非常小，而±壤中微生物種類多，TCK的DNA在± 壤樣品總DNA中的比例極低，使用常規PCR檢測不到小麥矮腥黑穗病菌，容易產生假陰性結 果。本發明提供的檢測方法，通過冷凍處理待測±壤樣品，改良DNA提取方法，從±壤中有 效提取出質量較好的DNA，再利用微滴數字PCR進行檢測，實現了±壤中小麥矮腥黑粉菌的 絕對定量，有利于小麥矮腥黑穗病的早期預警，及時采取防治措施，減少經濟損失。
[0037] 本發明提供的DNA提取方法能夠有效地提取出±壤樣品的總DNA，并且DNA的質量 較好，其0D260nm/0D280皿的比值均在1.8至1. 9左右，濃度均在200~30化g/μL，提高了 后續檢測結果的可信度，避免因DM質量不好造成假陰性結果。
[0038] 本發明提供的方法利用靈敏度和準確度更高的微滴數字PCR