一種鑒定三帶喙庫蚊的實時熒光pcr引物和探針及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于昆蟲鑒定技術領域。更具體地，設及一種用于海濱庫蚊亞組中Ξ帶瞭 庫蚊鑒定的實時巧光PCR引物和探針及其應用。
【背景技術】
[0002] Ξ帶瞭庫蚊（化lex tritaeniorhynchus)屬雙翅目蚊科庫蚊屬庫蚊亞屬海濱庫蚊 組海濱庫蚊亞組，兼吸人和動物血，是流行性乙型腦炎的主要傳播媒介。主要分布：國內除 新疆、西藏未見記錄，分布于全國各地；國外分布于己基斯坦、印度、孟加拉國、斯里蘭卡、細 甸、泰國、柬捕寨、越南、馬來西亞、新加坡、印度尼西亞、菲律賓、日本、朝鮮、原蘇聯、中東、 東非等。
[0003] 海濱庫蚊亞組蚊種包括：海濱庫蚊、Ξ帶瞭庫蚊、白霜庫蚊、環帶庫蚊、偽雜鱗庫 蚊等，主要鑒定特征是翅無顯著的黑白斑，但雄蚊尾器結構復雜，同一亞組形態特征極為接 近，鑒定難度大。Ξ帶瞭庫蚊是該亞組中具有重要醫學意義的蚊種，主要鑒別特征：頭頂豎 鱗暗而平齊；盾鱗暗棟呈花椒色；雄蚊觸須第3節腹面有一行垂毛；雌蚊食竇甲齒纖維狀； 后股末端黑環很窄；幼蟲7-I分2芒枝；巧齒末端圓而有鍵。但受限于鑒定人員的經驗積 累，僅憑形態學鑒定將Ξ帶瞭庫蚊與同一亞屬蚊種進行鑒別需要有豐富經驗；同時在捕獲 不同發育階段蚊種時，需培養至成蟲進行鑒定，耗時較長；因采集工具等原因破壞標本的完 整性，給形態學鑒定帶來更大困難。
[0004] 傳統媒介蚊種形態學鑒定方法存在著鑒定專家數量有限、鑒定周期長、鑒定效率 低等問題，隨著分子生物學技術發展，基于DNA序列的物種分子鑒定技術應運而生，該技 術不受蚊蟲發育階段和性別限制，且只需一部分組織提取到足夠量的核酸也可進行分類 鑒定，成為傳統形態學鑒定的重要補充。蚊類分子鑒定技術主要包括W下幾種方法：1、限 制性片段長度多態性（restrictionfragmentlengthpolymo巧hism，RFLP)，結果穩定可 靠，重復性好，但靈敏度不高，不易自動化；2、隨機擴增多態性DNA技術（RandomAmplified PolymorphicDM,RAPD)，技術簡單，檢測速度快，但實驗的穩定性和重復性差；3、基于PCR 技術擴增基因組DNA限制性片段（amplifiedfragmentlengthpolymo;rphism)，兼具RAPD 與RFLP的優點，有較高穩定性，但對基因組制備純度要求較高；4、DNA忍片技術，用于多種 分子標記檢測，但設備和檢測成本較高；5、DNA測序技術，結果直觀可靠，可對傳統分類有 疑問的類群或形態分類不能解決的問題進行分析探討，也可對傳統分類系統進行驗證，但 也存在成本較高，耗時較長問題；6、PCR和巧光PCR技術，通過擴增特異性片段進行物種鑒 定，操作簡便，成本較低，但找到適用的物種特異性DNA片段是難點。
[0005] LydiaA.化11等建立快速鑒定白紋伊蚊、埃及伊蚊和盾蚊伊蚊實時巧光PCR方 法，適用于蚊發育各個階段的鑒定。與普通PCR相比，巧光PCR具有靈敏度高、特異性強、操 作簡便、檢測時間短等優點。同時巧光PCR的擴增和產物分析都在一封閉的管中進行，較之 傳統的PCR方法大大減少了污染的幾率，也具有較好的生物安全性。對于Ξ帶瞭庫蚊的巧 光PCR鑒定方法還未有報道。
【發明內容】
[0006] 本發明要解決的技術問題是克服形態學鑒定海濱庫蚊亞組蚊種鑒定難題，提供一 種一種快速、準確、特異性高、敏感性強的鑒定海濱庫蚊亞組中Ξ帶瞭庫蚊的實時巧光PCR 方法和試劑盒。
[0007] 本發明的目的是提供上述實時巧光PCR的引物、MGB探針和檢測方法。
[0008] 本發明上述目的通過W下技術方案實現：本發明所述的一種用于海濱庫蚊亞組中 立帶瞭庫蚊鑒定的巧光PCR引物和探針，其特征在于，所述引物包括上游引物化lex-F和下 游引物Culex-R，上游引物Culex-F由沈QIDNO. 1所示的序列，下游引物Culex-R由沈QID NO. 2所示的序列；所述探針為Tritaeniorhynchus-P探針，探針Tritaeniorhynchus-P由 沈QIDNO. 3所示的序列。巧光PCR上游引物化lex-F為沈QIDNO. 1所述的序列：5'-ΤΤ CAAGTAGTTTAGTAGAAAATGGAGC-3';巧光PCR下游引物Culex-R為沈QIDNO. 2 所述的序列： 5，-TGTAAAGAAAAAATAGCTAAATCAACTG-3，；巧光PCR探針Tritaeniorhynchus-P為沈QID NO. 3 所述的序列：FAM-5' -ACAGTTTATCCACCTCT-3' -MGB。
[0009] 所述探針Tritaeniorhynchus-P的5'端標記有FAM，3'端標記有非巧光澤滅基團 NFQ和MGB。
[0010] 本發明所述Ξ帶瞭庫蚊實時巧光PCR引物和探針在鑒定Ξ帶瞭庫蚊方面的應用。
[0011] 本發明所述Ξ帶瞭庫蚊實時巧光PCR引物和探針在制備Ξ帶瞭庫蚊鑒定試劑或 試劑盒中的應用。
[0012] 本發明所述的一種用于海濱庫蚊亞組中Ξ帶瞭庫蚊鑒定的巧光PCR檢測方法，其 PCR反應所用的引物和探針為權利要求1所述的引物和探針。
[001引本發明所述的PCR反應體系為：5μL模板DNA，10ymol/L上游引物Culex-F0. 625μL10μmol/L下游引物Culex-R0. 5μL10μ°Cmol/L巧光探針 Tritaeniorhynchus-P1. 25μL2X實時巧光PCR預混試劑和余量(1地20,共 25μL; PCR反應程序為：預變性94°C2min;94°C5s，58°C45s，共40個循環；58°C收集巧光信 號；根據擴增曲線、Ct值確定檢測結果的陰性和陽性； 其中，實時巧光PCR預混試劑包含有實時巧光PCR反應所需要的DNA聚合酶、緩沖液和 dNTPo
[0014] 本發明所述的一種用于海濱庫蚊亞組中Ξ帶瞭庫蚊鑒定的試劑盒，包括：權利要 求1或2所述的上游引物Qilex-F和下游引物Qilex-R，W及Tritaeniorhynchus-P探針， 實時巧光PCR反應體系中的DNA聚合酶、巧光PCR預混試劑，其中巧光PCR預混試劑包含有 實時巧光PCR反應所需要的緩沖液和dNTP。
[0015] 上述的單份25μL的實時巧光PCR反應體系使用的DM聚合酶量為0. 5~1U;單份 25μL的實時巧光PCR反應體系中各dNTP的終濃度為0. 2mmol/L。
[0016] 本發明公開一組用于海濱庫蚊亞組中Ξ帶瞭庫蚊的實時巧光PCR引物和探 針，所述引物包手上游引物化lex-F和下游引物化lex-R，上游引物化lex-F的序列 如SEQIDNO. 1所示，下游引物化lex-R的序列如SEQIDNO. 2所示；所述探針為 Tritaeniorhynchus-P，MGB探針Tritaeniorhynchus-P的序列如沈QIDNO. 3 所示。
[0017] 其中所述探針Tritaeniorhynchus-P的5'端有報告巧光基團FAM，3'端為非巧光 澤滅基團和MGB修飾基團。
[0018] 上述鑒定海濱庫蚊亞組中Ξ帶瞭庫蚊的實時巧光PCR引物和探針在鑒定Ξ帶瞭 庫蚊方面的應用也在本發明的保護范圍之內。
[0019] 上述鑒定海濱庫蚊亞組中Ξ帶瞭庫蚊的實時巧光PCR引物和探針在制備鑒定Ξ 帶瞭庫蚊試劑或試劑盒方面的應用也在本發明的保護范圍之內。
[0020] 應用時，所述引物的優選退火溫度為58°C。
[0021] 本發明還W上述引物和探針建立了一種鑒定海濱庫蚊亞組中Ξ帶瞭庫蚊的實時 巧光PCR方法。
[002引PCR反應體系為：5μL模板DNA，10μmol/L上游引物Culex-F0. 625μL，lOymol/L下游引物Qilex-R0. 5yL10ymol/L巧光探針Tritaeniorhynchus-P 1. 25μL2X實時巧光PCR預混試劑和余量(1地20,共25μL。
[0023]PCR反應程序：預變性 95°C30s;95°C5s，58°C45s，共 40 個循環。
[0024] 其中，所述實時巧光PCR預混試劑為商品化的寶生物(大連)有限公司的PremixEx TaqΤΜ(ProbeqPCR)試劑，包含有實時巧光PCR反應所需要的DM聚合酶、緩沖液和dNTP。 PCR反應程序根據所選用試劑不同可進行調整。
[00巧]另外，上述引物和探針構建的Ξ帶瞭庫蚊鑒定試劑盒也在本發明保護范圍之內。
[0026] 在實際應用工作中，利用本發明所設計的引物和探針鑒定Ξ帶瞭庫蚊，大致工作 流程如下：首先提取待測樣品DNA，再利用本發明設計的引物和探針或本發明建立的實時 巧光PCR方法進行檢測。對于待測樣品DNA沒有特殊的要求，按照本領域常規方法提取到 的樣品DNA均可用于檢測。
[0027] 本發明具有W下有益效果： 本發明公開了一組鑒定海濱庫蚊亞組中Ξ帶瞭庫蚊的實時巧光PCR引物和探針，能快 速、準確地從海濱庫蚊亞組蚊種中鑒定出重要醫學媒介--Ξ帶瞭庫蚊，具有良好地特異性 和敏感性。
[0028] 1.結果可靠，敏感性高：本方法與Ξ帶瞭庫蚊形態學鑒定結果完全一致，對海濱 庫蚊復合組其它蚊種無交叉反應，結果穩定可靠；可取單只蚊腿提取DNA進行檢測，具有較 高的敏感性。
[0029] 2.操作簡單、節省時間：本發明應用實時巧光PCR對蚊基因進行鑒定，操作簡單， 整個實驗過程在化內完成，適用于蚊生活史各個階段鑒定，無需培養至成蟲，節省時間。
[0030] 3.實驗可由一般技術人員操作，無需媒介鑒定專家在場，可W快速地從海濱庫蚊 亞組中鑒定出Ξ帶瞭庫蚊，解決海濱庫蚊復合組蚊種鑒定難題，對殘缺標本也可進行鑒定， 具有良好地應用前景。
【附圖說明】
[003。圖1是1~7號樣本實時巧光PCR靈敏度試驗結果圖，圖中：1 - 7依次 為 1XlO'copies/μL、IXl06copies/μL、1Xl05copies/μL、IXl04copies/μL、 1Xicfcopies/μL1Xl02copies/μLlOcopies/μL;8:陰性對照；9 :陽性對照。
[003引圖2是實時巧光PCR重復性試驗結果圖，圖中：1為陽性對照，2-9為 1Xicfcopies/μL質粒重復性試驗，10為陰性對照。
[0033] 圖3是實時巧光PCR特異性試驗結果圖。