一種沙門氏菌的核酸恒溫擴增檢測試劑盒及檢測方法
【專利說明】-種沙口氏菌的核酸恒溫擴増檢測試劑盒及檢測方法 (-)技術領域
[0001] 本發明設及一種針對沙口氏菌核酸的恒溫擴增快速檢測技術，適合對沙口氏菌的 定性檢測。 (二）【背景技術】
[0002] 沙口氏菌廣泛存在于自然界，至今已經發現的血清型就有2500種W上，我國已發 現216個。與人類疾病有關的血清型主要集中于A~E群，包括：傷寒沙口氏菌、甲、乙、丙型 副傷寒沙口氏菌、鼠傷寒沙口氏菌、豬霍亂沙口氏菌、腸炎沙口氏菌、鴨沙口氏菌、新港沙口 氏菌等，其中W鼠傷寒沙口氏菌、腸炎沙口氏菌及豬霍亂沙口氏菌最為常見。沙口氏菌引起 的食物中毒在日本、歐美占首位，亦是我國細菌性食物中毒的常見菌。在我國內陸地區，有 70%~80%細菌性食物中毒是由沙口氏菌引起的，是對人類和動物健康有極大危害的一類 食源性病原菌。
[0003] 沙口氏菌的傳統檢測多采用細菌培養、生化和血清學鑒定等方法，此類方法操作 繁瑣、費時費力、所需試劑繁多，經濟成本高。隨著免疫學和分子生物學的發展，現在已建立 了W抗原為主的免疫學檢測方法如化ISA法，W及WPCR為基礎的檢測技術。ELISA操作 較為繁瑣，費時較長；PCR檢測方法快捷，靈敏，準確度較高，但是需要一定的設備和技術要 求，且試劑費用較貴，難W推廣普及。為了實現基層能廣泛進行腸炎沙口氏菌的快速檢測， 有效防控該類細菌引起的食物中毒，建立實用、簡便、快速、準確的腸炎沙口氏菌檢測方法 十分必要。
[0004] 近年來，LAMP方法受到關注，該方法W特定核酸為目標在等溫條件下通過有鏈置 換酶活性的DNA聚合酶作用而擴增，具有特異性高、靈敏性強，而且簡便快速成本低廉的特 點。已在微生物檢測等諸多領域廣泛應用。本發明技術研制了恒溫擴增沙口氏菌核酸，并 結合核酸試紙條顯色來判定結果的檢測方法，且整個反應過程不打開反應管蓋子，試紙條 流動檢測過程密閉，杜絕了核酸擴增產物污染外界的可能性。研究表明該沙口氏菌恒溫擴 增-核酸試紙條檢測方法具有特異性強、敏感度高、對儀器要求簡單、檢測時間短等優點， 所W非常適用在基層檢驗機構使用，同時在突發公共衛生事件的現場檢測與臨床上的床邊 診斷上也具有很好的應用前景。 (Ξ)
【發明內容】
陽〇化]本發明目的是提供一種準確、靈敏、快速地檢測沙口氏菌核酸的恒溫擴增檢測試 劑盒及其檢測方法。
[0006] 本發明采用的技術方案是：
[0007] 本發明提供一種沙口氏菌的核酸恒溫擴增檢測試劑盒，所述試劑盒包括如下組 成：
[0008] (l)DNA提取試劑（優選Takara公司的BacterialGenomicDNAExtraction Kit(貨號DV810A);
[0009] (2)恒溫擴增反應液，包括：正向外圍引物、反向外圍引物、兩條探針、兩條交叉擴 增引物、lX化ermolbuffer、M拆04、dNTPs溶液、BstDNA聚合酶和無菌雙蒸水；其中：
[0010] 所述的外圍引物分別為：
[0011] 所述正向外圍引物為：5' -AACAGTGCTCGTTTACGACC-3'(沈QIDNO. 2); 陽01引 反向外圍引物為：5' -CTGATCGATAATGCCAGACG-3'(沈QIDNO. 3);
[0013] 所述兩條探針的序列分別為：
[0014] 正向 5'端Biotin標記探針：5' -Biotin-AGGTAGGTAATGGAATGACGA-3'(沈QID NO. 4)；
[0015]反向 5'端Fite標記探針 5' -Fitc-CGTTCTACATTGACAGAATCCTCAG-3'(SEQID NO. 5)；
[0016] 所述兩條擴增交叉引物分別為：
[0017] 擴增正向引物： 陽0化]5 ' -GCGATCAGGAAATCAACCAGATAGAATGGTGATGATCATTTCTATGTTC-3 '(沈QID NO.6)；
[0019] 擴增反向引物：
[0020] 5f-CGTACTGGCGATATTGGTGTTTATATTMCAGTACCGCAGGAAAC-3f(沈QIDNO. 7); 陽02U做陽性對照冶有沙口氏菌invA基因片段的DM質粒； 陽0巧 （4)陰性對照巧菌雙蒸水。
[0023] 進一步，本發明所述的1XThermolbuffer組成為：20mM的Tris-肥1、lOmM的 KCl、10mM的（NH4)2S〇4、2mM的Μ拆〇4^及質量濃度為 0. 1% 的TritonX-100，pH7. 5。
[0024] 進一步，本發明所述陽性對照為含有長238bp的沙口氏菌invA基因序列的片段， 所述片段的核巧酸序列如下（SEQIDNO. 1): 陽0巧]AACAGTGCTCGTTTACGACCTGAATTACTGATTCTGGTACTAATGGTGATGATCATTTCTATGTTCGTC ATTCCATTACCTACCTATCTGGTTGATTTCCTGATCGCACTGAATATCGTACTGGCGATATTGGTGTTTATGGGGTC GTTCTACATTGACAGAATCCTCAGTTTTTCAACGTTTCCTGCGGTACTGTTAATTACCACGCTCTTTCGTCTGGCAT TATCGATCAGTACCA
[00%] 進一步，本發明所述陽性對照按如下步驟制備：
[0027]W包含擴增區域的沙口氏菌invA基因片段為模板，通過兩條外圍引物進行PCR擴 增獲得目的基因；利用PCR純化試劑盒（Promega)對PCR擴增產物進行純化；將純化后的擴 增產物通過T-easy質粒轉染試劑盒（Promega)構建完整的含有目的基因的質粒序列，用分 光光度計對所抽提的質粒測A2S。定量并10倍稀釋，-2(TC保存。
[0028] 進一步，本發明所述恒溫擴增反應液組成為：兩條外圍引物各自1化mol,兩條探 針各自 20pmol，兩條交叉引物各自 40pmol，lXThe;rmolbuffer,Μ拆〇4為6mmol，dNTPs溶 液各0. 4mmol，BstDM聚合酶8U，無菌雙蒸水組成補足至25μ1。
[0029] 本發明還提供一種所述沙口氏菌的恒溫擴增檢測試劑盒的檢測方法，所述檢測方 法為： W30]a)用DNA提取試劑從待檢測的標本中提取DNA;
[0031]b)將步驟a)提取得到的DNA作為模板加入到裝有恒溫擴增反應液的PCR管中，在 65°C下擴增反應35分鐘；標準陽性模板（即陽性對照）加入陽性對照PCR管中，標準陰性 模板（即陰性對照）加入陰性對照PCR管中，所述標準陽性模板為含有沙口氏菌invA基因 片段的質粒，所述標準陰性模板為無菌雙蒸水；
[0032]C)將反應后的PCR管放置到核酸試紙條防污染檢測裝置（杭州優思達生物技術公 司3號裝置）中進行檢測，2分鐘W后判讀結果，當試紙條的檢測線呈陽性時，說明樣品中含 有沙口氏菌核酸。該試紙條包括在帶有不干膠的襯墊上按順序設有樣品墊、有色顆粒結合 物墊和吸水濾紙墊，上述各部分在相鄰處部分重疊，纖維膜上設有檢測線和質控線，其中有 色顆粒結合物墊上的有色顆粒有抗Fite抗體包被，檢測線上有親和素包被，質控線上有抗 Fite抗體，有色顆粒選自膠體金顆粒、乳膠顆粒。
[0033] 在本發明提供的試劑盒中，有兩條外圍引物，兩條交叉引物和兩條檢測探針。本試 劑盒中的6條寡聚核巧酸序列依靠BstDNA聚合酶的高活性的鏈置換特性，使得鏈置換DNA 合成不斷的自我擴增循環。在本發明提供的沙口氏菌核酸的恒溫擴增檢測試劑盒中，對不 同的反應條件進行了優化，如引物和探針的濃度，Mg2+濃度，反應溫度等的優化，并將本發明 與核酸檢測試紙條檢測系統相結合，建立了沙口氏菌核酸恒溫擴增定性檢測的方法。該試 劑盒的靈敏度可在每個反應體系中檢出10個拷貝，可W滿足快速檢測沙口氏菌核酸的要 求。
[0034] 本發明與現有技術相比，具有W下優點和效果：
[00對 （1)本發明所述沙口氏菌的核酸恒溫擴增檢測試劑盒的特異性好，靈敏度高，步驟 簡單，可重復性高；
[0036] (2)反應速度快，單個樣本從樣本處理到完成檢測，僅需1小時左右；
[0037] 做整個擴增和檢測過程中不需要打開PCR管蓋，減少了擴增產物污染的機會；整 個反應過程不需要復雜的儀器。 (四）
【附圖說明】
[0038] 圖1為核酸檢測試紙條原理示意圖。
[0039] 圖2為本發明試劑盒用于檢測沙口氏菌的特異性結果，圖中1-13分別表示傷寒沙 口氏菌CMCC50071、鼠傷寒沙口氏菌CMCC50115、福氏志賀氏菌CMCC51572、銅綠假單胞 桿菌（綠脈桿菌）ATCC27853、金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希氏菌ATCC25922、陰 溝腸桿菌ATCC13047、副溶血性弧菌ATCC17802、空腸彎曲菌ATCC33291、單增李斯特氏 菌ATCC19111、艱難梭菌ATCC9689、陽性對照品、陰性對照品的實驗結果。 W40] 圖3為本發明試劑盒用于檢測沙口氏菌的靈敏度，圖中1-6分別表示104拷貝/微 升、1〇3拷貝/微升、102拷貝/微升、101拷貝/微升、10°拷貝/微升、陰性對照品的實驗結 果。 (五）
【具體實施方式】
[0041] 下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于 此：
[0042] 實施例1本發明試劑盒的組成與配制
[0043]a)DNA提取試劑（優選Takara公司的BacterialGenomicDNAExtraction Kit(貨號DV810A);
[0044] b)沙口氏菌核酸恒溫擴增反應液：兩條外圍引物（1化mol)，兩條探針（2化mol)和 兩條交叉引物（40pmol)，lXT