同時檢測引起蘋果牛眼果腐病的4種病原菌的實時熒光pcr引物探針組合及方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及分子生物學檢測技術，具體地說，設及一種同時檢測引起蘋果牛眼果 腐病的4種病原菌的實時巧光PCR引物探針組合及方法。
【背景技術】
[0002] 蘋果牛眼果腐病度uirs-eyerotofapple)是我國關注的進境水果真菌病害， 病原菌包括Neofabraeamalicorticis、N.perennans、N.a化a和N.kienholzii運 4 個種， 其中N.malicodicis(異名：Peziculamalicodicis)被列入我國進境植物檢疫性有害生 物名錄中。蘋果牛眼果腐病是蘋果和梨重要的采后病害，難W防控，不僅為害果實，導致嚴 重的采后損失，而且可侵害枝條、樹干，導致樹勢衰弱、幼樹死亡。其在世界范圍內廣泛分 布，但尚未在我國發現。該病一旦傳入我國，在我國蘋果產區擴散、定殖的可能性很大，將對 我國蘋果生產造成嚴重威脅，十分必要加大口岸檢疫力度，嚴防該病菌的傳入。然而，蘋果 牛眼果腐病菌相似的形態特征和生理特性使運些病原菌的區分非常困難，要求鑒定者必須 具備豐富的真菌分類學基礎與經驗。加之傳統檢驗方法周期長，不符合進境水果快速通關 的要求，使其成為進境水果真菌病害檢疫的瓶頸。因此建立快速準確的檢測體系尤為必要。
[0003] 近年隨著分子生物學技術的迅速發展，大量WPCR為基礎的技術廣泛地運用到植 物病原菌的鑒定中，大大提高了鑒定的速度和準確性。實時巧光PCR結合了巧光檢測系統 和PCR擴增系統，通過巧光放大檢測信號，在PCR擴增的過程中就能檢測模板DNA的擴增， 不需要凝膠電泳分析，簡化了檢測程序，與常規的PCR比較更能縮短檢測周期。而且其檢測 特異性強，靈敏度高，其運用范圍越來越廣泛。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是針對W上要解決的技術問題，提供一種特異性好、靈敏度高的同 時檢測引起蘋果牛眼果腐病的4種病原菌的實時巧光PCR引物探針組合。
[0005] 本發明的另一個目的是提供一種用于實時巧光PCR檢測引起蘋果牛眼果腐病的4 種病原菌的試劑盒。
[0006] 本發明的再一個目的是提供同時檢測引起蘋果牛眼果腐病的4種病原菌的實時 巧光PCR方法。
[0007] 為了實現本發明目的，本發明提供了一種同時檢測引起蘋果牛眼果腐病的4種病 原菌的實時巧光PCR引物探針組合，該引物探針組合包括W下引物：
[0008] NeoF:5' -CCCTCGGTGGGGCAAAG-3';
[0009] NeoR:5' -CCAACTCGGCGGCTTCC-3f;
[0010] MAL-P：FAM-TCATCATCATTTTCATCATC-MGB；
[0011] 陽R-P:CY5-CGCGTATCGCAACATCATCATTTTCATCAT-B冊2 ;
[0012] ALB-P:肥D-AAGATGTTCAACCCCTCCCTCGCGTA-B冊 1 ;
[0013] KIE-P :肥X-TGACCACTTGATGATCTC-MGB ;
[0014] 其中，FAM、CY5、肥D、肥X為巧光基團，MGB、B冊1、B冊2為巧滅基團。
[0015] 上述引物中，Neo F和化0R為檢測蘋果牛眼果腐病的4種病原菌的通用引物； MAkPa為檢測N. malico;rticis的特異性探針；PER-Pb為檢測N. perennans的特異性探針； ALB-Pc為檢測N. a化a的特異性探針；KIE-Pd為檢測N. kienholzii的特異性探針。
[0016] 本發明還提供了用于實時巧光PCR檢測引起蘋果牛眼果腐病的4種病原菌的試劑 盒，該試劑盒含有上述引物探針組合。
[0017] 優選地，所述試劑盒還包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2\PCR反應緩沖液中的至少 一種。
[0018] 更優選地，所述試劑盒還包括陽性對照。
[0019] 本發明進一步提供了一種同時檢測引起蘋果牛眼果腐病的4種病原菌的實時巧 光PCR方法，即利用所述引物探針組合進行實時巧光PCR檢測待測樣品。
[0020] 具體地，所述方法包括W下步驟：1)提取待檢測樣品中的DNA;2)W步驟1)中提 取的DNA為模板，進行實時巧光PCR擴增反應；3)分析Ct值。
[002。 其中，實時巧光PCR反應體系W20μL計為：
[002引模板DNA 50ng，
[0023] 引物 每條引物的終濃度均為〇.5μπιο1/1，
[0024] 探針 每條探針的終濃度均為0. 25 μ mol/l，
[00巧]2XThunderbird Probe qPCR Mix 10 μL,
[0026] (1地2〇補足至20 μ L ;
[0027]其中，2XThunderbirdProbeqPCRMix內含DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反應緩沖 液、ROX。2X化underbirdProbeqPCRMix購自東洋紡（上海）生物科技有限公司，貨號 為WS-101。
[0028] 其中，實時巧光PCR反應條件為：95°C10分鐘；94°C15秒，60°C60秒，共40個循 環，每個循環結束后在FAM、CY5、肥D、肥X通道下檢測巧光信號。
[0029] 上述方法中，步驟3)中根據FAM、CY5、肥D、肥X通道下的巧光信號Ct值進行結果 判斷。若FAM通道下Ct值小于35,貝Ij判為N.malicodicis陽性，若Ct值大于35或無擴增 信號則判為N.malico;rticis陰性；若CY5通道下Ct值小于35,卯J判為N.perennans陽性， 若Ct值大于35或無擴增信號則判為N.perennans陰性；若肥D通道下Ct值小于35,卯J判 為N.a化a陽性，若Ct值大于35或無擴增信號則判為N.a化a陰性；若肥X通道下Ct值小 于35,卯J判為N.kienholzii陽性，若Ct值大于35或無擴增信號則判為N.kienholzii陰 性；
[0030] 本發明根據4種蘋果牛眼果腐病菌的EF-la基因特異序列，設計了 1對通用引物 和4條特異性探針，并基于運些引物探針組合建立了同時檢測引起蘋果牛眼果腐病的4種 病原菌的實時巧光PCR方法，可實現對樣品的定性檢測。
[0031] 實驗表明，本發明的引物探針組合、試劑盒及檢測方法特異性好、靈敏度高、通量 高、快速，提高了檢測效率，為引起蘋果牛眼果腐病的4種病原菌的檢測提供了更有效的方 法。
【附圖說明】
[0032]圖1為本發明在FAM通道下的特異性實驗結果，其中從左至右1-2分別為菌株CBS 102863、CBS102872。
[0033]圖2為本發明在CY5通道下的特異性實驗結果，其中從左至右1-6分別為菌株CBS 139. 4UCBS102869、CBS102873、CBS453. 64、VPRI41734、VPRI10502。
[0034]圖3為本發明在肥D通道下的特異性實驗結果，其中從左至右1-6分別為菌株CBS 109875、CBS102871、CBS628. 72、CBS452. 64、CBS304. 62、CBS261.32。
[0035] 圖4為本發明在肥X通道下的特異性實驗結果，其中1為菌株CBS355. 72。
[0036] 圖5為本發明在FAM通道下的靈敏度實驗結果，其中1-6分別為濃度10化g/μ^ lOng/μLIng/μLO.Ing/μLO.Olng/μL和 0.OOlng/μL。
[0037] 圖6為本發明在CY5通道下的靈敏度實驗結果，其中1-5分別為濃度l(K)ng/μL lOng/μL Ing/μLO. Ing/μL和 0.Olng/μL。
[0038] 圖7為本發明在肥D通道下的靈敏度實驗結果，其中1-6分別為濃度10化g/μL lOng/μLIng/μLO.Ing/μLO.Olng/μL和 0.OOlng/μL。
[0039] 圖8為本發明在肥X通道下的靈敏度實驗結果，其中1-6分別為濃度10化g/μL lOng/μLIng/μLO.Ing/μLO.Olng/μL和 0.OOlng/μL。
【具體實施方式】
[0040] W下實施例僅用于說明本發明，但不用于限制本發明的范圍。若未特別指明， 實施例均按照常規實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊（SambrookJ&Russell DW,Molecularcloning:a1油oratorymanual, 2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0041] 實施例1檢測引起蘋果牛眼果腐病的4種病原菌的實時巧光PCR引物探針組合
[0042] 根據引起蘋果牛眼果腐病的4種病原菌的EF-1α基因特異序列，設計了如下檢測 引起蘋果牛眼果腐病的4種病原菌的實時巧光PCR引物探針組合，引物序列如下：
[0043]NeoF:5' -CCCTCGGTGGGGCAAAG-3'(沈QIDNo. 1);
[0044]NeoR:5' -CCAACTCGGCGGCTTCC-3< (沈QIDNo. 2);;
[0045]MAL-P：FAM-TCATCATCATTTTCATCATC-MGB(SEQIDNo. 3)；
[0046]陽R-P:CY5-CGCGTATCGCAACATCATCATTTTCATCAT-B冊2(沈QIDNo. 4);
[0047]ALB-P:肥D-AAGATGTTCAACCCCTCCCTCGCGTA-B冊 1 (沈QIDNo. 5);
[0048]KIE-P:肥X-TGACCACTTGATGATCTC-MGB(SEQIDNo. 6);
[0049] 其中，FAM、CY5、肥D、肥X為巧光基團，MGB、B冊1、B冊2為巧滅基團。
[0050]NeoF和化οR為檢測蘋果牛眼果腐病的4種病原菌的通用引物；MAkP為檢測 N.malico;rticis的特異性探針；PER-P為檢測N.perennans的特異性探針；ALB-P為檢測 N.a化a的特異性探針；KIE-P為檢測N.kienholzii的特異性探針。
[0051] 實施例2檢測引起蘋果牛眼果腐病的4種病原菌的實時巧光PCR特異性實驗
[00閲 1、DNA的提取
[0053]提取表1中21株菌株的基因組DNA。將供試菌株在PDA平板上20°C黑暗培養7~ lOd，收集菌絲，液氮研磨，取0.Ig參照試劑盒說明操作（植物基因組DNA提取試劑盒，貨號 為DP305-02,天根生物科技有限公司）分別提取引起蘋果牛眼果腐病的4種病原菌的基因 組DM。
[0054]菌株1-13、16-19購買于荷蘭菌種保藏中屯、（CB巧；菌株14-15由澳大利亞環境與 初級產業部（Dep曰rtmentofEnvironment曰ndPrim曰ryIndustries,Austr曰li曰）提供； 菌株20保藏于廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中屯、，