用于檢測rs1800497的引物組合物、檢測試劑盒及檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及引物組合物、檢測試劑盒及檢測方法，具體設及用于檢測rsl800497 的A等位基因和G等位基因的引物組合物、基于前述兩種引物組合物的檢測試劑盒W及基 于前述檢測試劑盒的檢測方法，屬于生物技術領域。
【背景技術】
[0002] 多己胺值opamine，DA)，是在人體大腦內含量最為豐富的兒茶酪胺類神經遞質，可 調控人體中樞神經系統中多種重要的神經內分泌功能，并且與多種神經精神類疾病（如精 神分裂、帕金森病等）的發生密切相關。因此，近年來關于多己胺的分泌調控及其受體編碼 基因的研究，一直是神經科學領域研究的焦點。
[0003]DA在進行神經內分泌功能調控作用時，主要通過其相應的膜受體來發揮功能。研 究者們已成功分離出五種多己胺受體（DA2R),根據受體的生物化學和藥理學性質，可分為 D1和D2兩類受體。其中，D1類受體包括D1和D5兩種類型，而D2類受體包括D2、D3和D4 Ξ種受體。
[0004]目前，多己胺受體基因多態性與神經性精神病的相關性研究工作的重點主要集中 在D2受體上，D2受體由位于11號染色體llq23. 2的多己胺受體D2 (dopamine rec巧tor D2, D畑2)基因D畑2編碼，與D畑2基因相鄰的錯蛋白重復和激酶域1 (ankyrin repeat and kinase domain containing Ι,ΑΝΚΚΙ)基因近來同樣受到了臨床研究者們的關注。ANKKl 基因與DRD2基因存在片段重疊和共享單倍型區域，其8號外顯子上存在1個單核巧酸多態 性位點（SNP)rsl800497(c. 2317G〉A，Glu71：3Lys)，又稱D畑2TaqlA多態性。有證據顯示，攜 帶該SNP位點的等位基因可使大腦紋狀體內的DRD2密度下降，攜帶DRD化S1800497A等位 基因的患者在應用第二代抗精神病藥治療期間靜坐不能不良反應的發生率顯著高于該位 點GG基因型患者。所WCFDA發布的《藥物代謝酶和藥物作用祀點基因檢測技術指南（試 行）》指出，"攜帶rsl800497A等位基因的患者應用第二代抗精神病藥時靜坐不能不良反應 的發生風險增加，應注意。"
[0005] 目前，研究者們測定類多己胺D2受體的基因型時，采用的方法主要是PCR-RFLP 法、測序法運兩種。然而，運兩種方法操作繁瑣，需要反復開管操作，容易造成交叉污染，并 且測序法需要依賴非常昂貴的進口設備及試劑，更加難W大規模推廣。所W，開發一種價格 低廉，并且操作簡便，適合臨床大范圍普及推廣的DBD2等位基因的基因檢測試劑盒，對于 神經精神類疾病患者臨床藥物檢測方面的工作來講，具有非常大的價值。
[0006]環介導的等溫擴增（Loop-mediatedIsothermalAmplification,LAMP)是日本 科學家于2000年提出的一種核酸恒溫擴增技術，其主要特點是針對祀基因的6個區域設計 4條特異引物，在鏈置換DNA聚合酶度StDNApolymerase)的作用下進行恒溫擴增，僅需 15-90分鐘即可產生109-1〇1°數量級的產物。反應結束后通過肉眼直接觀察體系狀態的改 變來判定待測樣本的基因型，無需開管，因此大大簡化了操作步驟，同時又可W有效避免樣 本交叉污染，而且，僅需普通水浴鍋即可開展檢測，又節約了大量的檢測成本。
[0007] LAMP相對于其他W PCR為基礎的檢測手段而言，具有W下優越性：
[0008] (1)靈敏度高：LAMP擴增模板可低至6個拷貝，比傳統PCR法高出1000倍，具有與 實時化qman PCR同樣的靈敏度；
[0009] (2)特異性好：LAMP反應需要針對待擴增模板6個區域設計4條引物，只有運4條 引物都能完全與模板配對才能引發后續的擴增；
[0010] (3)操作簡便、成本低廉：LAMP只需配置好反應體系并置于等溫條件的水浴鍋或 者其他恒溫設備即可，無需任何昂貴的設備儀器，大大降低檢測成本；
[0011] (4)結果易于判定：LAMP反應的結果檢測甚至無需電泳，只需通過肉眼直接觀察 擴增管的濁度或者反應體系的顏色變化來判定結果即可。
[0012] 因此，LAMP是一種非常值得推廣的檢測手段。
[001引本發明在LAMP的基礎上，采用等位基因特異性環介導等溫擴增(Allele-Specific LAMP)技術，在特異性要求最為嚴格的Flc或者Blc的5'端（參照圖 1)，針對rsl800497的A等位基因和G等位基因設計特異引物W及檢測用的組合物及方法， 用于指導第二代抗精神病藥的個體化用藥。
【發明內容】
[0014] 本發明的目的在于：提供一種用于檢測rsl800497的A等位基因和G等位基因 的引物組合物，并提供一種基于前述兩種引物組合物的用于檢測rsl800497的檢測試劑 盒，同時在LAMP的基礎上提供一種基于該檢測試劑盒和等位基因特異性環介導等溫擴增 (Allele-Specific LAMP)技術的用于檢測rsl800497的方法，用于指導第二代抗精神病藥 的個體化用藥。
[0015] 為了實現上述目標，本發明采用如下的技術方案：
[0016] 一種用于檢測rsl800497的A等位基因的引物組合物，其特征在于，該引物組合物 由4條引物組成，前述4條引物的序列分別為：
[0017] F3A GCTTAGAACCACCCAGAGTG
[0018] B3A TGTCCACGCCCGCAA
[0019] FIPA ACTGGCCCTCCGCAGCCACTGACGGCTCCTTGCC
[0020] ΒΙΡΑ TGCCCAGCACTTTGAGGATGGCTGGGCTGGACACCCG,
[002。其中，ΒΙΡΑ是檢測A等位基因的特異引物。
[0022] 一種用于檢測rsl800497的G等位基因的引物組合物，其特征在于，該引物組合物 由4條引物組成，前述4條引物的序列分別為：
[0023] F3G TGCCCTGCTTTCGGCT
[0024] B3G GTCCACGCCCGCAAC
[00巧]FIPG GCGCCCAGCTGGACGTCGCGGAGGGCCAGTTGC
[0026] BIPG CGGCCAGCACTTTGAGGATGGCTGGGCTGGACACCCG,
[0027] 其中，BIPG是檢測G等位基因的特異性引物。
[0028] 一種用于檢測rsl800497的檢測試劑盒，其特征在于，該檢測試劑盒由反應體系A 和反應體系G組成，
[0029] 前述反應體系A的組分及含量為：
[0030]
[0031] 4條引物的序列分別為：
[0032]F3AGCTTAGAACCACCCAGAGTG
[0033]B3ATGTCCACGCCCGCAA
[0034]FIPAACTGGCCCTCCGCAGCCACTGACGGCTCCTTGCC
[0035]ΒΙΡΑTGCCCAGCACTTTGAGGATGGCTGGGCTGGACACCCG；
[0036] 前述反應體系G的組分及含量為：
[0037]
[003引4條引物的序列分別為：
[0039]F3GTGCCCTGCTTTCGGCT
[0040]B3GGTCCACGCCCGCAAC
[0041]FIPGGCGCCCAGCTGGACGTCGCGGAGGGCCAGTTGC
[0042]BIPGCGGCCAGCACTTTGAGGATGGCTGGGCTGGACACCCG。
[0043] 一種用于檢測rsl800497的方法，其特征在于，該檢測方法基于前述的檢測試劑 盒，包括W下步驟：
[0044] -、抽取靜脈血W邸TA抗凝管保存，每管取200ul血液，用DNA提取試劑盒提取全 基因組DNA作為檢測的模板，W超純水代替模板做陰性對照；
[0045] 二、將模板或超純水分別加入到反應體系A和反應體系G中，于60°C下反應 80min，之后升溫至80°C滅活20min，觀察體系顏色變化即可。
[0046] 本發明的有益之處在于：
[0047] -、引物組合物
[0048] LAMP反應的關鍵在于初始階段形成的由Blc為5'端，F1為3'端的啞鈴狀結構， 運個結構的穩定形成是發生后續LAMP反應的前提，本發明針對運一特征，結合待測DNA的 序列特點，將特異性引物設計在Blc的5'端，同時，又在其5'端的第Ξ位人為引進一個突 變，進一步加強了引物的特異性，有效防止了假陽性的產生。