一種豬腦蛋白酶解制備腦多肽和腦小分子肽的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物工程技術領域，具體設及一種豬腦蛋白酶解制備腦多膚和腦小分 子膚的方法。
【背景技術】
[0002] 哺乳動物腦蛋白的水解物，能治療一些腦功能疾病，已被臨床所證明。上世紀屯十 年代末期，奧地利一家名叫伊比威巧bewe)的藥廠研制出腦活素，臨床用于治療神經系統 疾病，特別是阿爾茨海默病的治療（AD、俗稱老年癡呆癥），能明顯延緩老年癡呆病變的進 展，改善癡呆癥狀，對腦中風、腦震蕩、腦損傷、腦動脈硬化、新生兒腦缺血缺氧性腦病等的 治療也有較好的療效。運種腦活素，是用豬腦蛋白經水解并進一步提純制得的一種生物制 劑，含有75 %的游離氨基酸和25 %的小分子膚。研究表明腦活素的藥理作用與其所含的 小分子膚類的多種活性存在量的關系。因此，近年來國內不少機構進行了大量研究，得到了 眾多的腦蛋白水解物產品進入臨床。
[0003] 據分析，鮮豬腦中含水率在78-82 %，蛋白質9-11 %，憐脂7-9 %，膽固醇3-3. 5 %。
[0004] 目前，由豬腦制備腦多膚和腦小分子膚的方法，從公開的文獻資料中主要是W下 幾種：
[00化](一）一種豬腦蛋白水解物中小分子膚的制備：將新鮮豬腦去膜、去血管、洗凈后 切碎，投入索氏提取器內、用丙酬回流12小時后，取出壓碎驚干，再用丙酬回流12個小時。 所得固形物再用乙酸按上述方法回流提取共24小時，驚干后即得豬腦脫脂蛋白粉。將脫 脂蛋白粉加入5倍的純凈水混合并加入豬腦蛋白粉重量2%的酸性蛋白酶、混勻后用冰醋 酸調PH值在2. 0-4. 0之間，然后過濾、濾液50°C減壓蒸干后分別用石油酸和無水乙醇攬拌 24小時、抽濾，濾餅真空干燥即得豬腦蛋白水解物，水解物溶解，用Se地adexG15凝膠柱吸 附，W0. 9 %化cl為洗脫液進行分離純化，分段收集各流份并脫鹽，冷凍干燥后既可得到不 同分子量范圍的小分子膚組份。
[0006](二）一種豬腦水解蛋白和單唾液酸四已糖神經節巧脂聯產工藝（選擇豬腦水解 蛋白部分），包括W下步驟：
[0007] 步驟1)將食品級新鮮豬腦粉碎后加入1-4倍體積的極性有機溶劑，勻漿2-4小時 后過濾、分別收集濾餅和濾液。
[0008] 步驟2)向步驟1所得的濾餅中加入1-3倍體積的丙酬，勻漿1-2小時脫去憐脂、 過濾、減壓濃縮、20-30°C干燥，獲得脫脂豬腦粉，向脫脂豬腦粉中加入鹽緩沖液調節PH值 為5-7,按照l-3g/L的比例分別加入2種或3種水解酶，在25-42Γ條件下水解2-10小時， 水解結束后，70-100°C滅活5-10分鐘，室溫放置降溫之后將水解物液經一定分子量的超濾 膜過濾，所得濾液再經截留分子量為100-500的納濾膜濃縮和真空冷凍干燥獲得注射級豬 腦水解蛋白。
[0009] (Ξ) -種腦蛋白水解液的提取方法，包括W下各步驟：
[0010] 步驟1)取新鮮豬腦或冷凍豬腦，摘除小腦干，并去除大腦組織表面的筋膜。用純 化水或注射用水清洗干凈，加入1-2倍純化水或注射用水，用膠體磨勻漿2-3次。
[0011] 步驟2)取步驟（1)的勻漿液、加熱至35-45Γ、調PH值至7. 5-8. 5,加漿重0. 5-2. 5 %的膜蛋白酶，攬拌反應2-8小時，調節PH值至2. 0-2. 5,加熱至90°CW上保溫10-30分鐘， 冷卻至溫室度、離屯、。 陽01引步驟如取步驟似離屯、上清液，按體積比1-3 :1-3加入40-50W/V%徑胺溶液，調 節PH值為1. 5-2. 5,在80-100°C密閉條件下反應10-30小時，冷卻至40°CW下，調PH值至 6. 9-7. 5,離屯、過濾。
[0013] 步驟4)取步驟（3)的離屯、上清液、超濾，收集濾液即為蛋白水解物溶液。
[0014](四）一種從動物腦中提取腦活素的方法，包括W下步驟： 陽01引步驟1)將豬腦加蒸饋水、用化(oH) 2調PH值7-9。
[0016]步驟2)加豬或牛膜酶、甲苯、蒸饋水在37-50條件下，攬拌10-20小時，用憐酸調PH值為5. 7-5. 8. 陽017] 步驟3)煮沸、過濾、濾液用化1調PH值為6-7、減壓濃縮，低溫冷卻再濃縮，用化0H 調PH為7-9減壓濃縮干燥。
[0018] 步驟4)將濃縮至干的物料加水溶解，過濾、濾液用化1調PH值為4-5,用活性炭脫 色、過濾、濾液濃縮后用截留分子量為10000的透析袋進行對水透析24小時，過濾，透析液 加NaHS03,過濾，分裝滅菌而成。
[0019](五）一種制取豬腦多膚的方法，包括W下步驟：
[0020] 將新鮮豬腦勻漿，Ξ次凍融，在-20°C冷凍12-24小時后，再恢復室溫至溶解，如上 述重復操作Ξ次，使細胞破碎，加入膜蛋白酶進行酶解，酶解液經微濾和能攔截10000化的 超濾膜過濾，透過液即為腦多膚。
[0021] 上述5種制取豬腦多膚的方法中，方法（一）、（二）、（Ξ)具有大量使用有機溶 劑，生產成本高，生產安全和勞動安全要求高的缺點；且生產周期長，僅分離出腦蛋白的時 間分別是48小時、30小時和40小時。方法（四）和方法（五）唯不使用有機溶劑，但生產 周期長，從投料到出產品需要3-4天。
[0022] 公開于該【背景技術】部分的信息僅僅旨在增加對本發明的總體背景的理解，而不應 當被視為承認或W任何形式暗示該信息構成已為本領域一般技術人員所公知的現有技術。
【發明內容】
[0023] 為了克服現有技術的不足，本發明提供了一種從豬腦中制取腦蛋白膚的方法。
[0024] 為解決上述技術問題，本發明采用W下技術方案：
[0025] 一種豬腦蛋白酶解制備腦多膚和腦小分子膚的方法，包括如下步驟：
[0026] (1)取出鮮豬腦或解凍的冰凍豬腦，用純凈水洗凈表面的污物、血水及雜質，摘取 筋膜、血管；
[0027] 似將清洗干凈的豬腦，按原料與純凈水比例為1:0.8-1.0混合后，用膠體磨研 磨勻漿，初磨時調到最粗的細度，待組織基本破碎完后再調至較細的細度，研磨勻漿循環 8-lOmin/批，然后添加為勻漿2倍的純凈水繼續勻漿2-3min，把每批次勻漿好的腦漿液混 合均勻，用化0H溶液調PH值至9.0;
[0028] (3)將調節好的腦漿勻漿液，置于帶攬拌裝置的微波罐中，控制溫度55°C，微波 20-25min，保溫 15min;
[0029] (4)將經過微波處理的勻漿液排出，在40-50°C用蝶式高速離屯、機兩次分離蛋白 和脂質，第一次離屯、控制排出的輕液在35-45%之間，排出的輕液后，再微波15min后，進行 第二次離屯、，第二次離屯、所得的輕液即為憐脂溶液，將兩次離屯、的所得的濃液混勻；
[0030] (5)將步驟4所得的混勻濃液，用稀鹽酸調PH值至4. 3-4. 5,操作使混勻濃液獲得 最佳沉析點，使蛋白質成雲狀大片沉出，很快分層，然后用200目濾布離屯、機脫液，收集濾 渣，濾渣即為腦分離蛋白；
[0031](6)將收集的濾渣，添加為濕濾渣量2-2. 5倍的純凈水，使溶液的濃度在5-8%，用 化0H溶液調PH值為9.0,投入膠體磨將粘結的腦分離蛋白打散均勻，隨后添加按分離蛋白 質量4. 5%的膜酶巧OOOu/g)繼續勻漿循環，數分鐘后檢測漿液的PH值，當PH值下降至8. 0 W下時，補堿調PH值至8. 2-8. 5,再循環數分鐘再檢測漿液PH值，當PH值再下降至7. 5左 右時，再補堿調至8.6,再循環3分鐘，將漿液排出； 陽0巧 （7)將步驟（6)得到的漿液送入微波前檢測PH值，當PH值小于7. 5時，補堿調PH值至7. 8,進行微波輔助酶解，微波15-20min，控制溫度小于55°C，當酶解液PH值下降 至7. 2時結束酶解，啟動微波罐最大微波功率，將酶解液升溫至85°C時，保溫5-lOmin，滅酶 活；
[003引 做將已滅酶活的酶解液排出，酶解液溫度下降小于50°C時，在攬拌條件下，添加 入用15%醋酸溶解1. 5%殼聚糖溶液，調節PH值至4. 8-5. 0,沉析未酶解的腦蛋白、憐脂及 其它大分子雜質；沉析物用200目濾布離屯、過濾，去除沉淀；
[0034] (9)步驟（8)所得的離屯、液，用0.45um中空纖維膜進行微濾，濾液用能攔截分子量 10000化的超濾