一種微生物體內合成脂肪醇乙酸酯的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物基因工程領域，具體涉及改造微生物代謝途徑，從單糖直接合成信息素脂肪醇乙酸酯的方法。
【背景技術】
[0002]1、昆蟲性信息素，又稱性外激素(人工合成用于防治害蟲的又稱為性引誘劑)，是由同種昆蟲某一性別個體的特殊器官分泌于體外，能被同種異性個體的感受器所接受，并使其產生相應行為反應或生理效應(如覓偶、定向求偶、交配等)的微量化學物質。至今，已鑒定出約2000種昆蟲性信息素，大多數性信息素為各種脂肪醇乙酸酯分子。目前已有少數昆蟲性信息素實現了化學全合成。由于應用昆蟲性信息素進行害蟲監測和防治具有高效、無毒、無污染、不傷害天敵昆蟲等優點，國內外學者十分重視對昆蟲性信息素的研究和應用。
[0003]2、昆蟲性信息素是昆蟲本身的產物，因此其最大的優點就是使用非常安全，害蟲不產生抗性、靈敏度高、用量少、專屬性強、不污染環境、對天敵無害甚或有利，對生態環境的干擾小、不造成破壞。目前昆蟲性信息素被用于蟲情檢測、大量誘捕、干擾交配、配合治蟲、害蟲檢疫、區分近緣種等方面。但由于絕大多數的種類的昆蟲性信息素還未能實現商品化生產，限制了其更廣泛的應用。
[0004]3、目前已商品化的性信息素均為通過化學法合成。化學法合成性信息素需涉及到多個反應步驟導致合成成本較高。通過生物技術手段，實現微生物發酵單糖合成各種性信息素，可有效的降低成本。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供一種微生物體內合成脂肪醇乙酸酯的方法，在微生物內構建一條由單糖轉化到脂肪醇乙酸酯的代謝途徑。
[0006]為實現上述目的，本發明提供了在大腸桿菌合成脂肪醇乙酸酯的方法，合成示意圖如圖1所示，主要步驟為:
(1)構建基于脂酰-ACP為前體分子產脂肪醇乙酸酯工程菌將來自Symchococcusies菌的脂酰-ACP還原酶AAR基因、大腸桿菌的醛還原酶AHR基因和釀酒酵母醇乙酰基轉移酶ATF1基因，重組到載體pET28a(+)上，得到載體pDY05o將該載體轉入到大腸桿菌中，實現上述三個基因在大腸桿菌中的高量表達，得到大腸桿菌工程菌株⑶Y2。表達AAR用于催化脂酰-ACP還原為脂肪醛，表達AHR用于隨后催化脂肪醛還原形成脂肪醇，表達ATF1用于最終催化脂肪醇與乙酰輔酶A反應合成脂肪醇乙酸酯。脂酰-ACP和乙酸輔酶A均可由大腸桿菌發酵單糖合成，為此上述構建的GDY2工程菌可有效的將單糖轉化為脂肪醇乙酸酯。
[0007](2)構建基于脂肪酸為前體分子產脂肪醇乙酸酯工程菌將來自Mycobacterium菌的羧酸還原酶CAR基因和釀酒酵母醇乙酰基轉移酶ATF1基因，重組到載體pET28a(+)上，得到載體pDYlO。將來自大腸桿菌的醛還原酶AHR及硫酯酶‘TESA基因、枯草芽孢桿菌磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶Sfp基因，重組到載體PBBR1MCS1上，得到載體pDY09。將上述兩個載體同時轉入到大腸桿菌中，實現上述五個基因在大腸桿菌中的高量表達，得到大腸桿菌工程菌株⑶Y4。表達‘TESA用于水解脂酰-ACP產生脂肪酸，表達CAR用于催化脂肪酸還原為脂肪醛，表達Sfp用于活化CAR酶，表達AHR用于隨后催化脂肪醛還原形成脂肪醇，表達ATF1用于最終催化脂肪醇與乙酰輔酶A反應合成脂肪醇乙酸酯。脂肪酸和乙酸輔酶A均可由大腸桿菌發酵單糖合成，為此上述構建的GDY4工程菌可有效的將單糖轉化為脂肪醇乙酸酯。
[0008](3)構建基于脂酰-ACP和脂酰-C0A為前體分子產脂肪醇乙酸酯工程菌將來自Marinobacter菌的脂酰_CoA還原酶FAR基因和釀酒酵母醇乙酰基轉移酶ATF1基因，重組到載體pET28a(+)上，得到載體pDY12。將該載體轉入到大腸桿菌中，實現上述兩個基因在大腸桿菌中的高量表達，得到大腸桿菌工程菌株⑶Y6。表達FAR用于催化脂酰-ACP和脂酰-C0A還原為脂肪醇，表達ATF1用于最終催化脂肪醇與乙酰輔酶A反應合成脂肪醇乙酸酯。脂酰-ACP、脂酰-C0A和乙酸輔酶A均可由大腸桿菌發酵單糖合成，為此上述構建的GDY6工程菌可有效的將單糖轉化為脂肪醇乙酸酯。
[0009]本發明的優點是在大腸桿菌引入外源基因構建一條合成脂肪醇乙酸酯的代謝途徑，最終實現以單糖為原料合成脂肪醇乙酸酯的目的，不需要通過過多的化學合成反應，減少化學合成過程中有毒物質的釋放，也減少了合成成本。同時，由于大腸桿菌生長速度快，遺傳操作技術成熟，且發酵過程不會對環境造成污染破壞。
【附圖說明】
[0010]圖1.生物合成脂肪醇乙酸酯路徑圖。ATF1:醇乙酰基轉移酶(alcoholacetyl transferase)來自 S.cerevisiae 菌；AAR:脂酰-ACP 還原酶(fatty acyl- ACPreductase)來自 S.elongates 菌;CAR:竣酸還原酶(carboxylic acid reductase)來自M.marinum菌；FAR:脂酰-CoA還原酶(fatty acyl- CoA reductase)來自 M.aquaeolei菌；AHR:酸還原酶(aldehyde reductase)來自 E.coli 菌;FadD:脂酰-CoA合酶(fattyacyl-CoA synthetase)來自 E.coli ; ’ TesA:去除信號肽的硫酯酶(a truncated fattyacyl-ACP th1esterase)來自 E.coli 菌.圖2.基于脂酰-ACP為前體分子合成脂肪醇或脂肪醇乙酸酯的大腸桿菌工程菌⑶Y1和⑶Y2發酵產物GC-MS檢測結果。1號峰代表內標碳十五脂肪酸甲酯(MethylPentadecanoate), 2號峰代表碳十五脂肪醇內標(Pentadecanol)，3號峰代表碳十六脂肪醇乙酸酯(Hexadecanol acetate ester)，4號峰代表碳十六脂肪醇(Hexadecanol )，5號峰代表Δ 9-碳十八稀脂肪醇乙酸酯(9-0ctadecen-l-ol acetate ester)，6號峰代表Δ9_碳十八稀脂肪醇(9-Octadecen-l-ol alcohol)。
[0011]圖3.基于脂肪酸為前體分子合成脂肪醇或脂肪醇乙酸酯的大腸桿菌工程菌⑶Y3和⑶Y4發酵產物GC-MS檢測結果。1號峰為碳十二脂肪醇乙酸酯(Dodecanolacetate ester)，2號峰為碳十二脂肪醇(Dodecanol )，3號峰為Δ 9_碳十二稀醇(9-Dodecanol-l-ol)，4 號峰為碳十四脂肪醇乙酸酯(Tetradecanol acetate ester),5號峰為碳十五脂肪酸甲酯內標(Methyl Pentadecanoate)，6號峰為碳十四脂肪醇(Tetradecanol)，7號峰為△ 9_碳十四稀醇(9-Tetradecen-l-ol)，8號峰為碳十五醇內標(Pentadecanol)，9 號峰為 Δ9-碳十六稀醇乙酸酯(9-Hexadecen-l-ol acetateester), 10號峰為碳十六脂肪醇(Hexadecanol)，11號峰為Δ 9_碳十六稀脂肪醇(9-Hexadecen-l-ol), 12 號峰為 Δ 9_ 碳十八稀醇乙酸酯(9-Octadecen-l-ol acetateester), 13 號峰為 Δ 9_ 碳十八稀醇(9-Octadecen-l-ol)。
[0012]圖4.基于脂酰-ACP和脂酰-CoA為前體分子合成脂肪醇或脂肪醇乙酸酯的大腸桿菌工程菌GDY5和GDY6發酵產物GC-MS檢測結果。1號峰為碳十四脂肪醇乙酸酯(Tetradecanol acetate ester)，2號峰為碳十五脂肪酸甲酯內標(MethylPentadecanoate)，3號峰碳十四脂肪醇(Tetradecanol )，4號峰為△ 9_碳十四稀醇(9-Tetradecen-l-ol)，5號峰為碳十五醇內標(Pentadecanol)，6號峰為碳十六脂肪醇乙酸酯(Hexadecanol acetate ester)，7號峰為Δ 9_碳十六稀醇乙酸酯(9-Hexadecen-l-ol acetate ester),8 號峰為碳十六脂肪醇(Hexadecanol)，9 號峰為Δ 9-碳十六稀脂肪醇(9-Hexadecen-l-ol)，10號峰為Δ9-碳十八稀醇乙酸酯(9-0ctadecen-l-ol acetate ester), 11 號峰為 Δ 9_ 碳十八稀醇(9-Octadecen-l-ol)。
【具體實施方式】
[0013]本發明的目的通過以下措施來達到:
1、在微生物體內表達AAR和AHR基因，用于催化脂肪酸合成途徑中間體脂酰-ACP還原為脂肪醇。表達ATF1基因用于催化脂肪醇和乙酰輔酶A兩個底物合成脂肪醇乙酸酯。
[0014]2、在微生物體內表達‘TESA用于水解脂酰-ACP產生脂肪酸，表達CAR用于催化脂肪酸還原為脂肪醛，表達Sfp用于活化CAR酶，表達AHR用于隨后催化脂肪醛還原形成脂肪醇，表達ATF1用于最終催化脂肪醇與乙酰輔酶A反應合成脂肪醇乙酸酯。
[0015]3、在微生物體內表達FAR用于催化脂酰-ACP和脂酰-C0A還原為脂肪醇，表達ATF1用于最終催化脂肪醇與乙酰輔酶A反應合成脂肪醇乙酸酯。
[0016]4、本發明的三個工程菌，其細胞生長快速，能夠利用單糖為唯一碳源合成脂肪醇乙酸酯。
[0017]以下實施例用于進一步說明本發明，但不應理解為對本發明的限制。
[0018]實施例1構建基于脂酰ACP為前體分子產脂肪醇乙酸酯大腸桿菌工程菌(圖1所示)
A)構建產脂肪醇工程菌
1、利用引物 AAR-Xbal (GTATCTAGAAAGAGGAGATATAATGTTCGGTCTTATCGGTCATCTC)和AAR-Spel-BamHI (TGTGGATCCACTAGTTCAAATTGCCAATGCCAAGG) PCR 擴增來自 Syrwchococcuselongates菌的AAR基因，隨后將擴增的片段以插入到pET28a(+)中得到載體 pDYOΙο 利用引物 AHR-Xbal (ATATCTAGAAAGAGGAGATATAATGTCGATGATAAAAAGCTATGCCG)和AHR-Spel-BamHI (GTAGGATCCACTAGTTCAAAAATCGGCTTTCAACACCAC)PCR 擴增來自大腸桿菌的AHR基因，利用ZAaiiP及碰￥/插入到pET28a (+)中得到載體pDY02。利用Xbal和Xhol雙酶切pDYOl得到AAR表達框，將其插入以Spel和Xhol雙酶切的載體pDY02上，得到重組載體PDY03。
[0019]將重組載體pDY03導入大腸桿菌GM1655中，得到⑶Y1工程菌。該工程菌實現了AAR和AHR基因的高表達。表達AAR酶用于催化脂肪酸合成中間體脂酰-ACP還原為脂肪醛醛，表達AHR酶用于催化脂肪醛還原為脂肪醇醇。
[0020]B)構建產脂肪醇乙酸酯工程菌
1、利用引物 ATFl-Xbal (GGATCTAGAAACTTTAAGAAGGAGATATAATGAA TGAAATCGATGAGAAAAATCAGG) and ATF1-Spe1-SacI(GATGAGCTCACTAGTCTAAGGGCC TAAAAGGAGAGCTTTGTAA) PCR擴增來自釀酒酵母菌的ATF1基因，隨后將擴增的片段以Xbal和SacI雙酶切插入到pET28a (+)載體中，得到載體pDY04。以Xbal和Xhol雙酶切載體pDY03，得到AAR和AHR