一種基于核酸擴增技術的微流控檢測芯片及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于農產品、食品質量安全分子檢測應用技術領域，具體涉及一種基于核酸擴增技術的微流控檢測芯片及其制備方法。該芯片為4層、圓盤離心式設計，每張芯片分為20個樣品區，每個樣品區包含12個檢測小室。配套光驅型離心機、溫控設備及核酸擴增試劑耗材，可滿足農產品、食品中轉基因成分、致病菌、動植物物種等分子檢測需要，具有快速、便捷、通量高等特點。
【背景技術】
[0002]分子檢測技術是一種以農產品、食品中核酸差異為分析目標的的新型檢測技術，克服了傳統檢測技術中傳統的檢測手段具有靈敏度低、特異性差、成本高、費時費工等明顯缺點。目前主流的分子檢測技術有PCR、實時熒光定量PCR、數字PCR、環狀等溫擴增、基因芯片技術等，具有快速、精準、靈敏度高、特異性強、高通量等優點，已經成熟應用于微生物鑒定、轉基因成分、物種鑒定等檢測領域。
[0003]聚合酶鏈式反應技術誕生于1985年，利用變性與復性原理，在體外使用DNA聚合酶，在引物的引導和脫氧核糖核苷酸(dNTP)的參與下進行百萬倍擴增；反應步驟包括變性、復性和延伸，在1-2小時內選擇性地放大特定的DNA片段，通過電泳進行產物分析。具有快速、穩定、普及率高的特點。實時熒光定量PCR技術于1996年由美國Applied B1systems公司推出，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析；與常規PCR的定性分析相比，real timePCR具有定量分析、通量高、自動化程度高等特點。環狀等溫擴增技術(Loop-mediatedisothermal ampl1-ficat1n),是 2000 年日本學者 Notomi 在 Nucleic Acids Res 雜志上公開了一種新的基因診斷技術。其原理是針對靶標DNA序列6個區域設計4條引物，利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶和DNA在65 °C左右的動態平衡狀態，使得鏈置換DNA合成在不停地自我循環。基因芯片(GeneChip、DNA Microarray)是指將大量核酸片段(寡核苷酸/PNA、cDNA、基因組DNA)以預先設計的方式固定在載玻片、尼龍膜等載體上組成密集分子排列，通過與標記樣品進行雜交，檢測雜交信號的強弱進而判斷樣品中靶標DNA序列的數量及組成。基因芯片技術的基本流程包括DNA方針的構建、樣品制備、雜交、雜交圖譜掃描，具有檢測通量高、高達自動化、效率高、特異性強的技術優點。
[0004]分子檢測技術推動農產品、食品質量安全，但還存在方法體系不夠健全、解決問題不夠全面、配套產品不夠完善的問題。微流控芯片可以提高完整的平臺。
[0005]微流控芯片(microfluidic chip)最初在美國被稱為“芯片實驗室” (lab-on-a-chip)，在歐洲被稱為“微整合分析芯片” (micrototal analyticalsystems)，是把生物和化學領域所涉及的基本操作單元集成在一塊幾平方厘米的芯片上。操作級別單元尺寸在微米量級。已經在新藥篩選、細胞捕獲、分選、代謝反應觀察、食品、農產品安全如農獸殘、重金屬、添加劑檢測中應用。該平臺具有以下優點:
[0006]I樣品需要量小、低能耗
[0007]2分離效率高、分析速度快
[0008]3設備體積小、集成化
[0009]4高通量、自動化程度高
[0010]本專利立足我國農產品、食品中分子檢測產品發展需要，利用微流控芯片便攜、高效、高通量的優勢和核酸擴增技術的快速特點，發明了一種基于核酸擴增技術的微流控檢測芯片及其制備方法，具有實際應用價值。
【發明內容】
[0011]本發明的目的在于公開了一種基于核酸擴增技術的微流控檢測芯片及其制備方法，其特征在于該芯片外觀呈光盤狀，外徑120mm，內徑15mm ;該芯片共有4層組成，分別為底板層、引物層、反應層、進樣層；該芯片分為20個反應區，每個反應區包括序號標示點、I個進樣孔和12個反應小室，因此可滿足20個樣品、每個樣品最多12個參數的檢測。
[0012]為實現上述目的，本發明參與以下制作步驟:
[0013](I)使用計算機軟件繪制出微流控檢測芯片每一層的結構和通道圖形，用于后期的噴繪、打印和刻蝕。
[0014](2)在底板層上噴繪出20個序號標示點和20個反應區。
[0015](3)在引物層上應用打印技術在20個反應區、每個反應區12個反應小室共240個區域噴墨打印寡聚核苷酸弓I物序列，冷凍干燥保存。
[0016](4)在反應層上刻蝕出20個樣品室、通道和240個反應室，每個反應室體積約
I μ Lo
[0017](5)在進樣層上打印出進樣標線，刻蝕出20個進樣孔。
[0018](6)對應疊加、貼合4層結構，形成三維立體的微流控檢測芯片。
[0019]本發明設計和制作的微流控檢測芯片，可采用下述方法使用:
[0020](I)提取待測樣品DNA模板，稀釋至20_100ng/ μ L，取I μ L模板、加入核酸擴增反應體系(含有熒光顯色劑)共16 μ L，混勻，使用排槍5通量加入樣品室。
[0021](2)將加完樣品的微流控檢測芯片放入光驅式離心機，1200rpm離心lmin，置于溫控設備中進行擴增。
[0022](3)擴增結束后，日光燈或紫外燈或成像設備中觀察檢測結果。
[0023]本發明中所述的核酸擴增技術，包括PCR技術、實時熒光PCR技術、環狀等溫擴增技術等，其目的是在短時間內獲得大量的擴增產物，以滿足結果觀察的需要。
[0024]本發明所述的寡核苷酸引物序列，是針對目的基因，結合核酸擴增方法，設計、合成的引物序列，其目的是錨定特異序列區域進行擴增。本發明將引物序列采用噴墨打印的方式將引物打印在芯片第二層上，并通過真空干燥的方法進行固定。
[0025]本發明所述的待測樣品DNA模板，指的是使用DNA提取試劑盒從農產品、食品中提取的基因組DNA。
[0026]為了能更加清楚的說明本發明的測定方法，下面對本發明的試驗方法做以詳細的說明。
[0027]I 原理
[0028]本發明的檢測微流控芯片采用4層、圓盤式設計，利用離心力的原理，將反應試劑通過管道輸送到反應小室中進行反應；整個芯片的制作應用了打印、噴墨、刻蝕等技術，在有機材料中形成三維立體的通道和小室。
[0029]2外觀設計
[0030]其特征在于該芯片外觀呈圓盤狀,大小同光盤大小一致,外徑120mm,內徑15mm ；該芯片共有4層組成，分別為底板層、引物層、反應層、進樣層；每個芯片分為20個反應區，每個反應區包括序號標示點、I個進樣孔和12個反應小室，因此可滿足20個樣品、每個樣品最多12個參數的檢測。
[0031]3制作步驟
[0032](I)使用計算機軟件繪制出微流控檢測芯片每一層的結構和通道圖形，用于后期的噴繪、打印和刻蝕。
[0033](2)在底板層上噴繪出20個序號標示點和20個反應區(圖1)。
[0034](3)在引物層上應用打印技術在20個反應區、每個反應區12個反應小室共240個區域噴墨打印寡聚核苷酸引物序列，冷凍干燥保存(圖2)。
[0035](4)在反應層上刻蝕出20個樣品室、通道和240個反應室，每個反應室體積約I μ L (圖 3)。
[0036](5)在進樣層上打印出進樣標線，刻蝕出20個進樣孔(圖4)。
[0037](6)對應疊加、貼合4層結構，形成三維立體的微流控檢測芯片(圖5)。
[0038]4應用方法
[0039](I)使用DNA提取試劑盒提取待測樣品DNA模板，稀釋至20_100ng/ μ L ;取I μ L模板、加入核酸擴增反應體系(含有熒光顯色劑)共16 μ L，混勻，使用排槍5通量分4次加入20個樣品室。
[0040](2)將加完樣品的微