抗pmi蛋白的單克隆抗體及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及識別非抗生素類安全篩選標記PMI(磷酸甘露糖異構酶）的單克隆抗 體，該抗體可用于制備檢測轉基因植物中的PMI蛋白的試劑盒，屬于生物檢測領域。
【背景技術】
[0002] 隨著轉基因產品的不斷涌現，隨之而來的問題就是轉基因產品的安全評價及測 定。在轉基因品種的培養和后期鑒定中，離不開針對轉化的篩選標記和報告基因，最常用 的篩選標記包括抗生素抗性類篩選標記基因和抗除草劑基因，這類抗性篩選標記基因有可 能會通過基因漂移造成基因污染，對環境產生不利影響（魏偉，馬克平.如何面對基因流 和基因污染[J].中國農業科技導報，2002,4(4):10-15)。另外，含有該種標記基因的轉 基因食物有可能不會被人類的腸道系統吸收利用，還很有可能產生毒副作用。所以，為降 低生物安全風險，減少對環境和生物的潛在危害，目前對轉基因植物的篩選已經逐漸由利 用抗生素抗性篩選，過渡到以PMI為代表的非抗生素抗性篩選，最終實現更安全的無標簽 (Marker-free)篩選鑒定體系。
[0003] 在糖類代謝中，PMI基因編碼的磷酸甘露糖異構酶（phosphomannoseisomerase， PMI)催化甘露糖-6-磷酸轉變為果糖-6-磷酸，然后在磷酸果糖激酶的催化作用下生成 能進入糖酵解途徑的果糖 -1，6_ 二磷酸（MilesJS，GuestJR.Nucleotidesequence andtranscriptionalstartpointofthephosphomannoseisomerasegene(manA)of Escherichiacoli[J]·Gene, 1984,32:41-48)。研究發現幾乎所有植物細胞除了肉桂和一 些豆類，都沒有PMI基因，但在細菌、酵母、動物以及人體中卻廣泛存在（MalcaI，EndoRM， LongMR.Mechanismofglucosecounteractionofinhibitionofrootelongation bygalactose,mannoseandglucosamine[J] ·Phytopathology, 1967, 57:272-278),目前 已從這些生物體中克隆到該基因，并獲得純化蛋白（ProudfootAEI，TurcattiG，Wells TNC,etal. .Purification,cDNAcloningandheterologousexpressionofhuman phosphomannoseisomerase[J] ·Eur.J.Biochem. ,1994,219:415-423.)〇
[0004] 自1998年首次報道了將PMI基因作為篩選標記用于甜菜的轉基因以來（Joersbo M,DonaldsonI,KreibergJ,etal.Analysisofmannoseselectionusedfor transformationofsugarbeet[J].Mol.Breed·,1998,4:111_117)，PMI/甘露糖篩選體系 作為一種新型的安全篩選系統已被成功運用于多種單子葉植物和雙子葉植物的遺傳轉化 中無論是篩選標簽選擇、更替的過程，還是在后代選擇中通過同源重組將篩選標簽從生物 體基因組"刪除"的過程中都需要對標簽蛋白進行跟蹤鑒定。此外，對這些標簽蛋白進行檢 測還可以監測品種培育過程中對環境的影響，結合特異功能靶蛋白的鑒定，可以開展農業 生產中的種子純度鑒定，食品、藥品加工過程的非轉基因身份保持（IP)，從而實現對轉基因 植物從源頭到餐桌的全程監控。
[0005] 基于外源蛋白的免疫學分析方法，采用高度特異性的抗原抗體反應，可實現對轉 基因植物樣本快速、準確、高效的檢測。其技術關鍵是制備具有高度特異性的抗體，直至目 前為止還沒有關于PMI抗體的報道。
【發明內容】
[0006] 本發明的第一個目的是提供一種針對轉基因植物中常用篩選標記基因PMI蛋白 的單克隆抗體雜交瘤的制備方法。
[0007] 本發明的第二個目的是提供一種特異性好、親和力高的抗PMI單克隆抗體，該抗 體能特異結合PMI重組抗原和轉基因材料。
[0008] 本發明的第三個目的是提供一種將本抗體用于以水稻為代表的轉基因生物的檢 測方法。
[0009] 本發明的第四個目的是提供一種利用本抗體與PMI的結合能力，完成表達PMI蛋 白在轉基因植物、轉基因動物、轉基因微生物、細胞或其他材料中的分選和富集方法。
[0010] 解決技術問題所采用的技術手段
[0011] 本發明首先制備了兩株分泌抗PMI抗體的雜交瘤細胞株，所述雜交瘤細胞株的制 備方法包括以下步驟：
[0012] 1)按照公布的PMI編碼序列進行分析，依據在細胞膜上的結構、抗原性、組成氨 基酸的親疏水性以及二級結構，選擇適宜可溶表達又具有良好免疫原性的區域用于重組表 達，為促進重組蛋白的可溶表達，改善其表達行為，且便于純化，在重組蛋白的N端和C端分 別融合有大腸桿菌果膠酶的PelB信號肽及組氨酸標簽，經基因合成后克隆進表達質粒載 體pET-pelB中進行重組表達，分離純化表達產物的可溶部分進行親和純化后作為免疫原， 免疫Balb/c小鼠。
[0013] 2)從免疫合格小鼠無菌取其脾細胞作為抗原致敏的B細胞，按常規方法，將B細胞 與骨髓瘤細胞SP2/0株融合，然后利用常規的融合細胞HAT篩選方法進行篩選，進而獲取融 合細胞生長克隆；
[0014] 3)以重組PMI蛋白為抗原，應用ELISA法和Western印跡法等生化和免疫學技術 篩選和鑒定后，獲得高效分泌單克隆抗體的陽性雜交瘤細胞系。
[0015] 上述技術方案中，步驟1)中，制備重組⑶S蛋白的方法可以按照本領域技術人員 熟知的DNA和蛋白質表達操作技術進行基因的分離、核苷酸片段的切割與連接、克隆和表 達載體的構建及擴增、核苷酸序列的分析與鑒定、細胞的轉化和培養，重組蛋白的純化。具 體地，可參考《分子克隆實驗指南（第三版）》(J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾著，黃培堂等譯， 2009年，科學出版社）。
[0016] 本發明同時要求保護采用上述技術方案制備得到的兩株雜交瘤細胞株及其抗體 60728-35和60728-44。其中60728-35的抗體的重鏈和輕鏈可變區氨基酸序列為SEQID No:2 和SEQIDNo:3 所示，60728-44 為SEQIDNo:4 和SEQIDNo:5 所示。兩株抗體均 為鼠源IgGl亞型單克隆抗體。
[0017] 本發明從上述雜交瘤細胞株制備了單克隆抗體，所述制備方法有以下兩種：
[0018] 1)在體外用無血清培養基培養雜交瘤細胞，收獲培養上清經免疫親和層析法分離 純化所需單克隆抗體；
[0019] 2)在動物腹腔內接種上述雜交瘤細胞，收獲動物腹水后分離純化所需單克隆抗 體。本發明用腹水法制備的抗體經ProteinA/G柱親和層析純化得到的PMI單抗，用ELISA 技術測定60728-35和60728-44分泌的抗體親和常數分別為1. 85X109和2. 46XΙΟ9。
[0020] 本發明的這兩株抗體可以共同或單一地對生物樣品中的ΡΜΙ蛋白進行免疫學檢 測。可以應用的免疫學檢測方法包括但不限于利用抗體直接和抗原結合的酶聯免疫吸附 檢測（ELISA)、免疫印跡（WesternBlot)、流式細胞術（FACS)、免疫組織化學（IHC)檢測 或者免疫PCR檢測方法。在免疫學檢測中，該抗體可單獨或與通過化學鍵偶聯，靜電吸 附或者親疏水性吸附，而連接綴合物包括辣根過氧化物酶（HRP)，堿性磷酸酶（AP)，生物 素（Biotin)，異硫氰酸熒光素（FITC)，Cy3、Cy5、磁珠和瓊脂糖等綴合物連接。免疫印記 (Westernblotting)實驗顯示這兩株抗體均能特異識別重組的PMI蛋白以及天然水稻葉 片材料中的轉基因篩選標記基因PMI。
[0021] 本發明中的單克隆抗體，可以用作檢測試劑用于轉基因植物檢測試劑盒的制備。 本發明的這兩株抗體還可以共同或單一地對含PMI蛋白的生物樣品進行基于免疫學的生 物分離中。該基于免疫學的分離方法包括但不限于利用瓊脂糖免疫、免疫磁珠吸附或流式 細胞術完成生物分離方法或陽性細胞分選。
[0022] 本發明的優點及有益效果
[0023] 本發明獲得的雜交瘤（60728-35和60728-44)分泌產生的單克隆抗體，能識別重 組和天然PMI蛋白，具有極強特異性和敏感性。能用于轉基因植物的檢測與篩查。
【附圖說明】：
[0024] 圖1 :在大腸桿菌中表達和純化的PMI重組蛋白。1為表達產物15mM咪唑洗脫的 結果，2為60mM咪唑洗脫的結果，3為300mM咪唑洗脫的結果。Marker為分子量蛋白，表達 產物的大小約為43kDa，使用12%SDS-PAGE凝膠。
[0025] 圖2 :單克隆抗體60728-35對重組蛋白和天然轉基因水稻葉片蛋白的免疫印跡檢 測結果，TP309為非轉基因材料，M2-B4和M3-3為轉基因水稻葉片蛋白，菌蛋白為重組PMI 蛋白。
[0026] 圖3 :單克隆抗體60728-44對重組蛋白和天然轉基因水稻葉片蛋白的免疫印跡檢 測結果，TP309為非轉基因材料，M2-B4和M3-3為轉基因水稻葉片蛋白，菌蛋白為重組PMI 蛋白。
【具體實施方式】
[0027] 下面結合圖表和具體實施的方式對本發明做進一步闡述，以使本領域技術人員可 以更清楚地得知本發明的技術方案，并非對本發明的限制。
[0028] 實施例1重組PMI蛋白的制備
[0029] 一、基因克隆
[0030] PMI單克隆Genbank中NC_004088. 1的核酸序列，設計特異性上游引物PMI-F: TATGTACATATGCAAAAACTCATTAACTC特異性下游引物PMI-R:AGTGCTCGAGCTTGTTGTAAACACGC， 從淋巴細胞中的反轉錄產物中擴增包括編碼第411位至第750氨基酸的基因片段。在PCR 的過程中在基因5'和3'端分別加入Ndel和Xhol酶切位點。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳 分離后回收，分別對回收的融合蛋白基因和用于表達的質粒載體pET_30a進行Ndel和Xhol 酶切，再次電泳回收，以T4DNA連接酶連接。連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞BL21，挑取 平板上的克隆接種，提取質粒DNA，進行PCR鑒定。PCR顯示融合蛋白基因陽性的克隆進行 測序分析，序列完全正確的克隆用于蛋白表達。
[0031] 二、蛋白表達和純化
[0032] 按1:100的比例將單菌落培養的過夜菌轉接至100mlLB培養基，加入終濃度為 50μg/ml的卡那霉素，37°C振蕩培養至0D6。。為(λ6~(λ8。加入(λlmol/L的IPTG，25°C 震蕩培養8h