與人血管內皮生長因子特異性結合的抗體或其抗原結合片段及其用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物醫藥領域，更具體的，本發明涉及與人血管內皮生長因子特異性 結合的抗體或其抗原結合片段及其用途。進一步，本發明涉及與人血管內皮生長因子特異 性結合的抗體或其抗原結合片段、分離的多核苷酸、制備該抗體或其抗原結合片段的方法、 雜交瘤、雜交瘤在制備單克隆抗體中的用途、包含該抗體或其抗原結合片段、該多核苷酸或 該雜交瘤的藥物組合物、用于鑒定能夠與人血管內皮生長因子結合的藥物的方法、藥物聯 合。
【背景技術】
[0002] 1971年Folkman首先觀察到當腫瘤體積超過l-2mm3,需要新血管的形成來維持生 長，從而最早提出腫瘤生長是血管依賴性的，并指出抗血管生成是控制腫瘤生長的新途徑。 已有研究表明，幾乎所有實體瘤的生長和轉移都依賴于腫瘤新血管的生成。
[0003] 1989 年FerraraN發現 了血管內皮生長因子（vascularendothelialgrowth factor，VEGF)，后來被證明是目前發現的最重要的血管形成因子之一，在腫瘤的血管生長 中發揮著重要作用。對腫瘤的浸潤和轉移有重要影響，在腫瘤的血管發生過程中發揮極其 重要的作用。VEGF既可以用于腫瘤治療的理想靶點，也可以作為進行腫瘤診斷和判斷預后 的標志物。VEGF是相對分子質量34000-42000Da的高度糖基化堿性同源二聚體糖蛋白，其 編碼基因位于染色體的6q21. 3,全長14kb，含有8個外顯子和7個內含子，可形成9種異構 體，主要包括VEGF121、VEGF165、VEGF189和VEGF206。其中多數組織以表達VEGF165為主。
[0004] VEGF和VEGFR2之間的結合是腫瘤血管生成的關鍵，阻斷他們之間的"同形體"則 抑制腫瘤血管生成。抗VEGFR2抗體對比貝伐單抗，可同時阻斷VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E的作用，具有更有效的抗血管生成效果，因而對腫瘤在體內轉移具有特別抑制性。 [0005] 然而，目前特異性識別VEGF的抗體仍有待改進。
【發明內容】
[0006] 本發明旨在至少在一定程度上解決上述技術問題之一或至少提供一種有用的商 業選擇。為此，本發明的一個目的在于提出一種能夠特異性與人血管內皮生長因子結合的 抗體或其抗原結合片段及其用途。
[0007] 在本發明的第一方面，本發明提出了一種與人血管內皮生長因子（huVEGF，在本文 中如無特別說明，VEGF指的是人血管內皮生長因子）特異性結合的抗體或其抗原結合片 段。根據本發明的實施例，該抗體或其抗原結合片段包括：具有下列至少之一氨基酸序列的 重鏈可變區：（1)SEQIDN0 :1所示的氨基酸序列（GYTFTNYGLN)，（2)SEQIDN0 :2所示的氨 基酸序列（WINTYTGEPTYADDFKG)，（3)SEQIDN0:3 所示的氨基酸序列（YGITYEWYFDV)，（4) 與（1)~（3)相比具有一個以上氨基酸保守突變的氨基酸序列。序列可以包含某些生物學 功能等同的氨基酸或"保守性替代"，其它序列可以包含功能非等同的氨基酸或"非保守性 替代"，其經基因工程改造以改進⑶R或含⑶R抗體的特性。
[0008] 根據本發明的實施例，該抗體或其抗原結合片段可以進一步包括：具有下列至少 之一氨基酸序列的輕鏈可變區：（5)SEQIDN0 :4所示的氨基酸序列（RASQDISNSLN)，（6)SEQ IDNO:5所示的氨基酸序列（YTSRLHS)，（7)SEQIDNO:6所示的氨基酸序列（QQGNTFPWT)， (8) 與（5)~（6)相比具有一個以上氨基酸保守突變的氨基酸序列。
[0009] 根據本發明的實施例，該抗體或其抗原結合片段的所述重鏈可變區具有如SEQID NO:7 所示的氨基酸序列（EVKLQESGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGLNWVKQAPGKGLKWMGWINTY TGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDMATYFCAKYGITYEffYFDVffGAGTTVTVSS)〇
[0010] 根據本發明的實施例，該抗體或其抗原結合片段的所述輕鏈可變區具有如SEQID NO:8 所示的氨基酸序列（DIVLTQSTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNSLNWYQQKPNGTVILLIYYTSRL HSGVPSRFSGSGSGAVYSLTISDLEQEDIATYFCQQGNTFPWTFGGGTKLEIKR)〇 [0011] 根據本發明的實施例，該抗體或其抗原結合片段的所述抗體為單克隆抗體。
[0012] 根據本發明的實施例，所述抗體為單鏈抗體、雙鏈抗體、嵌合抗體、人源化抗體或 其衍生物。
[0013] 發明人意外發現，根據本發明實施例的抗體或其抗原結合片段，能夠特異性識別 人血管內皮生長因子，并且能夠有效地阻斷人血管內皮生長因子與其受體的結合，進而阻 斷人血管內皮生長因子受體例如VEGFR1或2的相關信號通路，從而可以有效地抑制腫瘤的 增長。
[0014] 在本發明的第二方面，本發明提出了一種分離的多核苷酸，根據本發明的實施例， 該多核苷酸編碼前面所述的抗體或其抗原結合片段。
[0015] 根據本發明的實施例，前面所描述的多核苷酸，包含：重鏈可變區編碼序列，所述 重鏈可變區編碼序列具有如SEQIDN0 :9所示的核苷酸序列或其互補序列
和/或輕鏈可變區編碼序列，所述輕鏈可變區編碼序列具有如SEQIDN0 :10所示的核 苷酸序列或其互補序列
[0016] 發明人發現，通過采用根據本發明的多核苷酸，能夠有效地合成根據本發明實施 例的特異性識別人血管內皮生長因子的抗體或其抗原結合片段。關于特異性識別人血管內 皮生長因子的抗體或其抗原結合片段，前面所描述的特征和優點同樣適用該多核苷酸，在 此不再贅述。
[0017] 在本發明的第三方面，本發明提出了一種制備前面所述的抗體或其抗原結合片段 的方法。根據本發明的實施例，包括：使宿主細胞表達前面所述的多核苷酸。
[0018] 發明人發現，通過采用根據本發明的方法，能夠利用前面所述的多核苷酸有效地 合成根據本發明實施例的特異性識別人血管內皮生長因子的抗體或其抗原結合片段。關于 特異性識別人血管內皮生長因子的抗體或其抗原結合片段，前面所描述的特征和優點同樣 適用該方法，在此不再贅述。
[0019] 在本發明的第四方面，本發明提出了一種雜交瘤（雜交瘤細胞株WS006)，其以保 藏號CCTCC:C2014111，保藏于中國典型培養物保藏中心（CCTCC)，保藏時間：2014年6月10 日。發明人發現，通過采用根據本發明的雜交瘤，能夠有效地合成根據本發明實施例的特異 性識別人血管內皮生長因子的抗體或其抗原結合片段。關于特異性識別人血管內皮生長因 子的抗體或其抗原結合片段，前面所描述的特征和優點同樣適用該雜交瘤，在此不再贅述。
[0020] 在本發明的第五方面，本發明提出了前面所述的雜交瘤在制備單克隆抗體中的用 途。
[0021] 明人發現，通過采用根據本發明的雜交瘤，能夠有效地合成根據本發明實施例的 特異性識別人血管內皮生長因子的抗體或其抗原結合片段。關于特異性識別人血管內皮生 長因子的抗體或其抗原結合片段，前面所描述的特征和優點同樣適用該多用途，在此不再 贅述。
[0022] 在本發明的第六方面，本發明提出了前面所述的抗體或其抗原結合片段、前面的 多核苷酸、或前面所述的雜交瘤在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療癌癥或者抑制腫 瘤增殖。任選的，所述癌癥為黑色素瘤或肺癌。
[0023] 在本發明的第七方面，本發明提出了一種藥物組合物。根據本發明的實施例，該藥 物組合物包含前面所述的抗體或其抗原結合片段、前面的多核苷酸、或前面所述的雜交瘤。
[0024] 在本發明的第八方面，一種用于鑒定能夠與人血管內皮生長因子結合的藥物的方 法。根據本發明的實施例，該方法包括：
[0025] 在候選藥物存在時，使前面所述的抗體或其抗原結合片段與抗原接觸，并且確定 所述抗體或其抗原結合片段與所述抗原的第一結合量，其中，所述抗原為人血管內皮生長 因子或其片段；以及
[0026] 在不存在所述候選藥物時，使前面所述的抗體或其抗原結合片段與抗原接觸，并 且確定所述抗體或其抗原結合片段與所述抗原的第二結合量，其中，所述抗原為人血管內 皮生長因子或其片段，
[0027] 其中，所述第二結合量大于所述第一結合量是候選藥物能夠與人血管內皮生長因 子結合的指示。
[0028] 由此，通過采用該方法，能夠篩選與人血管內皮生長因子結合的候選藥物。
[0029] 在本發明的第九方面，本發明提出了一種藥物聯合。根據本發明的實施例，該藥物