一種丙型肝炎病毒重組蛋白的制備及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫藥領域，具體地說，本發明涉及一種丙型肝炎病毒重組蛋白的 制備及其應用。
【背景技術】
[0002] 丙型肝炎病毒（HepatitisCvirus,HCV)感染是導致人類肝硬化、肝癌的主要誘 因之一，在世界范圍內有約170, 000, 000人感染，感染率高達3%，極大威脅著人類的健康。 目前對于丙型肝炎病毒，尚無預防性或治療性疫苗可用。
[0003] 隨著臨床研究的深入，越來越多的證據表明中和抗體在HCV感染的控制、清除過 程中起著重要的作用。在病人體內，中和抗體的快速誘導，中和抗體的滴度、廣度與HCV感 染的清除直接相關。無論黑猩猩實驗還是病人臨床樣本分析均顯示，在HCV急性感染過程 中，快速誘導出的中和抗體可以有效控制和清除HCV感染；而在慢性感染病人體內，如果 在感染早期沒有誘導出高滴度中和抗體，即便晚期體內誘導出中和抗體，也無法控制病毒 的持續感染。因此，誘導高滴度的中和抗體反應是早期HCV疫苗研發的一個重要指標。然 而，由于HCV本身的高度變異性、血清中脂蛋白成分的包裹、糖基化對中和位點的掩護以及 干擾抗體的作用等原因，早期HCV候選疫苗所產生的抗體往往只對相同亞型病毒有中和效 果，不具有廣譜性。
[0004] 因此，本領域迫切需要開發能夠誘導針對所有或大多數亞型病毒的廣譜中和抗 體，以便用于開發HCV預防性疫苗。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種丙型肝炎病毒重組蛋白的制備及其應用。
[0006] 本發明的第一方面，提供了一種分離的HCV抗原肽，所述抗原肽源自HCV病毒的E2 蛋白（尤其是E2蛋白的胞外區），并且所述抗原肽的長度為200-350個氨基酸，并且所述抗 原肽可結合于抗HCV的抗體。
[0007] 在另一優選例中，所述HCV病毒為HCVlb型病毒；優選地，為Coni毒株。
[0008] 在另一優選例中，所述的抗原肽具有誘導廣譜中和抗體的能力，所述廣譜中和抗 體可結合于選自下組的至少6種或全部HCV毒株：Coni,PR52,PR79L9,JFH1，S52,HK6a，H77/ JFH1,Conl/JFHl,J6/JFH1,PR26,PR79L9,J8/JFH1,S52/JFH1,ED43/JFH1,PR26C3mt,SA13/ JFH1,HK6a/JFHl和QC69/JFH1。
[0009] 在另一優選例中，所述的抗原肽與受體SR-BI的結合活性A1與相應野生型E2蛋 白與受體SR-ΒΙ的結合活性的B1的比值A1/B1彡0. 7,較佳地彡0. 5,更佳地彡0. 2。
[0010] 在另一優選例中，所述的抗原肽選自下組：
[0011] ⑷具有SEQIDN0:5、SEQIDN0. :3、SEQIDN0. :4 或SEQIDN0. :2 所示氨基 酸序列的多肽；
[0012] (B)具有㈧中任一所示氨基酸序列彡80%同源性（優選地，彡90%的同源性； 等優選地彡95 %的同源性；最優選地，彡97 %的同源性）的多肽，且所述多肽具有與抗HCV的抗體的結合能力；
[0013] (C)將SEQIDN0:2-5中任一所示氨基酸序列經過1-5個氨基酸殘基的取代、缺失 或添加而形成的，且保留與抗HCV抗體結合能力的衍生多肽。
[0014] 在另一優選例中，所述的抗HCV抗體包括抗HCV野生型E2蛋白抗體，其中包括抗 血清、或抗HCV野生型E2蛋白的對應區域的單克隆抗體。
[0015] 在另一優選例中，所述的抗原肽選自下組：SEQIDN0:5、SEQIDN0. :3、SEQID NO. : 4、SEQIDNO. :2 或其組合。
[0016] 在另一優選例中，所述抗原肽采用化學合成或生物工程方法獲得，包括重組蛋白、 融合蛋白。
[0017] 在另一優選例中，所述的抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體或抗血清。
[0018] 在另一優選例中，所述的E2蛋白包括野生型和突變型的E2序列。
[0019] 本發明的第二方面，提供了一種融合蛋白，所述融合蛋白含有本發明第一方面所 述的抗原肽和任選的標簽序列和/或連接序列。
[0020] 在另一優選例中，所述標簽序列為6His序列。
[0021] 本發明的第三方面，提供了一種分離的多核苷酸，所述的多核苷酸編碼本發明第 一方面所述的抗原肽或本發明第二方面所述的融合蛋白。
[0022] 在另一優選例中，所述多核苷酸選自下組：
[0023] (a)編碼如SEQIDN0. : 2-5所示多肽的多核苷酸；
[0024] (b)序列如SEQIDNO. :9、SEQIDNO. :8、SEQIDN0. :7 或SEQIDN0. :6 所示的 多核苷酸；
[0025] (c)核苷酸序列與（b)所示序列的同源性彡95% (較佳地彡98% )的多核苷酸；
[0026] (d)如（b)所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短或添加1-60個（較佳地1-30， 更佳地卜1〇個）核苷酸的多核苷酸；
[0027] (e)與（a)-(d)任一所述的多核苷酸互補的多核苷酸。
[0028] 本發明的第四方面，提供了 一種表達載體，所述表達載體含有本發明第三方面所 述的多核苷酸。
[0029] 本發明的第五方面，提供了一種宿主細胞，所述的宿主細胞含有本發明第四方面 所述的表達載體，或者在基因組中整合有本發明第三方面所述的多核苷酸。
[0030] 在另一優選例中，所述的宿主細胞包括原核細胞和真核細胞。
[0031] 在另一優選例中，所述的宿主細胞包括果蠅S2細胞、大腸桿菌、酵母、CH0細胞、DC 細胞等。
[0032] 本發明的第六方面，提供了一種藥物組合物，所述的藥物組合物含有本發明第一 方面所述的抗原肽、本發明第二方面所述的融合蛋白、本發明第三方面所述的多核苷酸、本 發明第四方面所述的表達載體或者本發明第五方面所述的宿主細胞，以及藥學上可接受的 載體和/或輔料。
[0033] 在另一優選例中，所述的藥物組合物為疫苗。
[0034] 本發明的第七方面，提供了一種疫苗組合物，所述的疫苗組合物含有本發明第一 方面所述的抗原肽、本發明第二方面所述的融合蛋白、本發明第三方面所述的多核苷酸、本 發明第四方面所述的表達載體或者本發明第五方面所述的宿主細胞，以及免疫學上可接受 的載體和/或輔料。
[0035] 在另一優選例中，所述的疫苗組合物還含有佐劑。
[0036] 在另一優選例中，所述的佐劑包括氧化鋁、皂苷、quilA、胞壁酰二肽、礦物油或 植物油、基于囊泡的佐劑、非離子嵌段共聚物或DEAE葡聚糖、細胞因子（包括IL-1、IL-2、 IFN-r、GM-CSF、IL-6、IL-12 和CpG)。
[0037] 在另一優選例中，所述佐劑選自：鋁佐劑、鋁佐劑混合CpG、和弗氏佐劑。
[0038] 本發明的第八方面，提供了本發明第一方面所述的抗原肽、本發明第二方面所述 的融合蛋白、本發明第三方面所述的多核苷酸、本發明第四方面所述的表達載體或者本發 明第五方面所述的宿主細胞的用途，
[0039] (a)用于制備針對所述抗原肽的抗體；和/或
[0040] (b)用于制備治療或預防HCV感染相關疾病的藥物；和/或
[0041] (c)用于制備檢測HCV的試劑或試劑盒；和/或
[0042] (d)用于檢測抗HCV的抗體。
[0043] 在另一優選例中，所述的"檢測HCV的試劑或試劑盒"包括檢測片、檢測板、蛋白芯 片、液基芯片、磁珠。
[0044] 在另一優選例中，所述抗HCV抗體為人體液樣品中的抗HCV抗體。優選地，所述體 液是血液或唾液。
[0045] 本發明的第九方面，提供了一種免疫檢測試劑盒，所述試劑盒包括本發明第一方 面所述的用于檢測抗HCV抗體的抗原肽。
[0046] 在另一優選例中，所述試劑盒中可以包括一種或多種本發明第一方面所述的用于 檢測抗HCV抗體的抗原肽。
[0047] 在另一優選例中，所述試劑盒還包括載體，所述的抗原肽包被在所述載體上。
[0048] 在另一優選例中，所述免疫檢測試劑盒還包括標記的抗HCV抗體的二抗。二抗用 來檢測人血清中的抗體IgG，IgM，或IgA.所用標記物可以是辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶， 熒光分子FITC(或其它熒光標記），化學發光檢測。檢測方法可以是顯色法，熒光方法，化學 發光，電化學發光法進行定性、定量分析。
[0049] 在另一優選例中，所述的二抗是辣根過氧化物酶標記的二抗。
[0050] 本發明的第十方面，提供了一種本發明第一方面所述的抗原肽的制備方法，包括 以下步驟：
[0051] (a)培養本發明第四方面所述的宿主細胞，從而表達出本發明第一方面所述的抗 原肽；
[0052] (b)分離所述的抗原肽。
[0053] 在另一優選例中，所述的宿主細胞為果蠅S2細胞。
[0054] 在另一優選例中，在步驟（a)之前，所述方法還包括以下步驟：
[0055] (1)提供一編碼HCVE2蛋白的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列如SEQID NO. : 6-9 所示；
[0056] (2)制備含有步驟⑴中所述多核苷酸序列的載體；
[0057] (3)將步驟（2)中的載體導入宿主細胞，從而制得權利要求4所述的宿主細胞。
[0058] 在另一優選例中，所述載體為誘導型表達載體。
[0059] 在另一優選例中，所述載體為pcDNA3. 1 (+)質粒。
[0060] 在另一優選例中，在所述步驟（a)中，當所述宿主細胞中導入的載體為誘導型表 達載體時，在細胞密度彡IXl〇7/ml后再添加誘導劑。
[0061] 本發明的第十一方面，提供了一種治療方法，給需要的對象施用本發明第一方面 所述的抗原肽、本發明第二方面所述的融合蛋白、本發明第三方面所述的多核苷酸、本發明 第四方面所述的表達載體或者本發明第五方面所述的宿主細胞、本發明第六方面所述的的 藥物組合物或本發明第七方面所述的疫苗組合物。
[0062] 應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0063] 圖1顯示了sE2蛋白在S2細胞上清中的表達、鑒定與純化。（A)S2細胞sE2表達 質粒pMT-Bip/SE2/His示意圖。（B)sE2原始編碼基因（WT)與密碼子優化后的編碼基因 (0ΡΤΙ)克隆到上述載體上后，用磷酸鈣法瞬時轉染S2細胞。優化過的序列能夠更加高效地 表達sE2。（C)氯化鉻誘導后分別于第0, 3, 5, 7, 9天收取細胞上清，Westernblot檢測sE2 蛋白的表達情況，一抗為1:1000稀釋的鼠抗His單抗（abmart)，二抗為1:4000稀釋的HRP 標記的山羊抗鼠IgG。（D)SDS-PAGE膠考馬斯亮藍染色分析鎳柱純化后的sE2蛋白，大小約 46kDa。
[0064] 圖2顯示了sE2蛋白的特性分析。⑷未經PNGase處理和經過PNGase酶切的sE2 蛋白在SDS-PAGE膠電泳后Westernblot檢測，分別用1:1000稀釋的鼠His單抗（abmart) 和1:1000稀釋的鼠E2單抗（AP33)作為一抗，1:4000稀釋的AP標記的山羊抗鼠IgG作為 二抗。（B)分別用識別構象表位的單抗E2C1和識別線性表位的單抗AP33對sE2進行ELISA 檢測，以檢驗其抗原性。a-Core單抗為陰性對照。（C)sE2與野生型CH0細胞的結合情況。 (D)sE2與穩定表達HCV受體的細胞系CH0-⑶81的結合情況，約76. 2%的細胞能與sE2結 合。（E)sE2與穩定表達HCV受體的細胞系CH0-SRB1的結合情況，約64. 5%的細胞能與sE2 結合。（F)sE2可競爭性抑制HCV感染Huh7. 5. 1細胞。將不同濃度的sE2或BSA與Huh7. 5. 1 細胞37°C孵育1小時，而后加入HCVConl/JFH-1病毒進行感染，72h后進行HCVNS3蛋白 的免疫熒光染色，在熒光顯微鏡（Leica)下對每孔的熒光斑點數進行計數。以Oyg/mL的 熒光斑點數為空白對照組，感染抑制效果（％) =(空白對照組的熒光斑點數-相應孔中的 熒光斑點數）/空白對照組的熒光斑點數*100%。
[0065] 圖3顯示了sE2可特異性檢測HCV感染病人血漿。sE2包被的ELISA板，分別用 1:2000或1:20000稀釋的健康人血漿和丙肝病人血漿進行孵育，隨后孵育二抗、顯色，中止 顯色后讀取0D450。在1:20000稀釋時的病人血清也能顯示將近1. 0的讀值。
[0066] 圖4顯示了sE2蛋白可在BALB/c小鼠誘導良好的體液免疫反應。⑷免疫實驗 分組。sE2分別以鋁佐劑（Alum)、鋁佐劑+CpG、或弗氏佐劑（FA)為佐劑，并設PBS對照組。 (B)分別于第0, 2, 4周腹腔注射免疫BALB/c小鼠，分別于第0, 4, 6, 13, 17, 22, 25周取血， 用ELISA的方法檢測血清中針對sE2特異性抗體的終端滴度。為檢測免疫記憶，于第25周 進行一次加免，并在第27周取血檢測血清中特異性抗體的終端滴度。三個免疫組小鼠加強 免疫后的抗體終端滴度達到1〇5_1〇6。
[0067] 圖5顯示了sE2免疫后在兔體內誘導出的特異性高抗體的滴度隨時間變化情況。 用弗氏佐劑與sE2混合免疫新西蘭兔，免疫間隔為兩周，每隔2周采血。三免后三周處死， 收集血清。免疫后的抗體終端滴度達到1〇 6-1〇7。
[0068] 圖6顯示了sE2免疫小鼠血清能夠中和1-7型的HCV病毒。（A)sE2分別以鋁佐 劑、鋁佐劑+CpG、或弗氏佐劑為佐劑，腹腔注射免疫小鼠。小鼠第27周的抗血清1:40稀釋 后進行體外中和實驗，確定對所有7個亞型的13株不同HCV病毒的中和效果。（B)每組10 只小鼠的抗血清等體積混合后，對每株病毒中和50%的最高稀釋度。中和效果（％) =(免 疫前血清組的突光斑點數-相應孔