一種人類免疫缺陷病毒Vpr蛋白的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種人類免疫缺陷病毒Vpr蛋白的制備方法。
[0002]
【背景技術】
[0003]人類免疫缺陷病毒1 型(human immunodeficiency virus type 1，HIV_1)感染導致的獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)是在全球廣泛流行的嚴重疾病。HIV-1基因組包含(編碼基質蛋白、衣殼蛋白和核衣殼蛋白等)、pol (編碼蛋白酶、反轉錄酶和整合酶等)、env (編碼包膜蛋白gpl20和gp41等)三種結構基因，以及 tat、rev、nef、vpr、vpu.、Ki/六種調節 / 輔助基因[1] ([1] Frankel AD,Young JA.HIV-1: fifteen proteins and an RNA[J].Annual review of b1chemistry.1998,67:1-25.)，這些基因各自以不同的方式調節著HIV-1的生物學功能。
[0004]病毒蛋白R (viral protein R，Vpr)是由96個氨基酸組成、分子量大小約為14kD的輔助蛋白，通過與Gag蛋白p6區域直接作用而包裝于HIV-1病毒顆粒[2]( [2] MullerB， Tessmer U， Schubert U， Krausslich HG.Human immunodeficiency virus type 1Vpr protein is incorporated into the vir1n in significantly smaller amountsthan gag and is phosphorylated in infected cells [J].Journal of virology.2000, 74(20):9727-31.)D Vpr在HIV-1病毒復制與致病過程中發揮著重要作用，如促進整合前復合體的核運輸[3] ([3] Vodicka MA, Koepp DM, Silver PA, Emerman M.HIV-1 Vpr interacts with the nuclear transport pathway to promote macrophageinfect1n[J].Genes & development.1998，12 (2): 175—85.)、加強逆轉錄過程的保真度⑷([4] Rogel ME, ffu LI, Emerman M.The human immunodeficiency virus type 1vpr gene prevents cell proliferat1n during chronic infect1n[J].Journal ofvirology.1995，69⑵:882-8.)、誘導細胞周期阻滯于G2/M期從而抑制細胞增殖[5] ([5]Andersen JL， Le Rouzic E， Planelles V.HIV-1 Vpr: mechanisms of G2 arrest andapoptosis[J].Experimental and molecular pathology.2008，85(1):2-10.)、反式激活HIV-1長末端重復序列以誘導病毒基因轉錄和翻譯等([6] Wang L，MukherjeeS，Jia F，Narayan 0，Zhao LJ.1nteract1n of vir1n protein Vpr of humanimmunodeficiency virus type 1 with cellular transcript1n factor Spl andtrans-activat1n of viral long terminal repeat[J].The Journal of b1logicalchemistry.1995，270(43):25564-9.)。目前研究發現，Vpr 蛋白在 HIV-1 感染細胞的胞楽與胞核中均有表達[7 8] ([7] Jacquot G，Le Rouzic E，David A，MazzoliniJ，Bouchet J，Bouaziz S， et al.Localizat1n of HIV-1 Vpr to the nuclearenvelope:1mpact on Vpr funct1ns and virus replicat1n in macrophages[J].Retrovirology.2007,4:84.[8] Subbramanian RA, Kessous-Elbaz A， Lodge R， ForgetJ，Yao XJ, Bergeron D，et al.Human immunodeficiency virus type 1 Vpr is apositive regulator of viral transcript1n and infectivity in primary humanmacrophages[J].The Journal of experimental medicine.1998,187 (7):1103-11.)；更為重要的是，Vpr蛋白可以釋放入AIDS患者的血清和腦脊液中，并被多種細胞所攝取[9 10] ([9] Levy DN，Refaeli Y，MacGregor RR，Weiner DB.Serum Vpr regulatesproductive infect1n and latency of human immunodeficiency virus type 1 [J].Proceedings of the Nat1nal Academy of Sciences of the United States ofAmerica.1994，91 (23): 10873-7.[10] Levy DN, Refaeli Y，Weiner DB.ExtracellularVpr protein increases cellular permissiveness to human immunodeficiency virusreplicat1n and reactivates virus from latency [J].Journal of virology.1995,69(2):1243-52.)。在 AIDS 患者血清中，Vpr 濃度約為 1-10 ng/mL[11] ([11] HoshinoS，Sun B，Konishi M，Shimura M，Segawa T，Hagiwara Y，et al.Vpr in plasma ofHIV type 1-positive patients is correlated with the HIV type 1 RNA titers[J].AIDS research and human retroviruses.2007，23 (3): 391-7.)D 因此 Vpr 蛋白在 HIV-1感染過程中起到的重要作用可通過多種機制實現，其中存在于體液中的Vpr蛋白能夠進入并破壞未感染的細胞，并誘導正常細胞的凋亡，可作為應用于腫瘤基因治療的潛在蛋白。
[0005]既往對于Vpr的研究通常以完整病毒感染作為模型，但基于生物安全性方面的考慮，研究者們現在更傾向于通過單獨表達的胞外Vpr蛋白來研究其生理作用。例如從患者血清和腦脊液中純化得到具有功能的Vpr蛋白，并且純化所得的Vpr蛋白在CD4+ T細胞和神經元細胞中分別具有反式激活和細胞毒作用[9]。但從AIDS患者血清和腦脊液中獲得Vpr蛋白的方法存在以下不足:一是在操作過程中仍然存在安全隱患；二是制備方法的復雜性；三是獲得的Vpr蛋白純度不夠理想，抗原性不強。本發明提供的利用原核表達系統獲得的HIV-1 Vpr重組蛋白純度較高，具有抗原性，能夠以可溶性蛋白的形式被B淋巴細胞和內皮細胞所攝取，進入細胞后可發揮誘導細胞凋亡的功能，并且制備過程相對安全簡單，能夠用于Vpr抗體的檢測，對于研究HIV-1的致病機制和檢測方法具有重要的理論和臨床意義。
[0006]
【發明內容】
[0007]發明目的:本發明提供一種人類免疫缺陷病毒Vpr蛋白的制備方法，根據HIV-1 Vpr基因構建重組原核表達質粒pColdll-Vpr，使用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β -D-l-th1galactopyranoside，IPTG)在大腸桿菌中誘導重組蛋白表達，并通過鎳柱親和層析法進行純化，制備人類免疫缺陷病毒Vpr蛋白。
[0008]本發明的技術方案:
一種人類免疫缺陷病毒Vpr蛋白的制備方法，包括如下步驟:以SEQ ID No:3~4為引物，GenBank登錄號NC_001802的序列為模板，進行PCR擴增，獲得目的基因；用限制性內切酶Nde I和Xba I對PCR產物和pColdll載體進行酶切、純化、連接，轉化至大腸桿菌，培養后用誘導物誘導表達，經超聲破碎后對蛋白質進行分離純化。
[0009]所述PCR 擴增條件為:95°C預變性 5 min，然后 95°C 1 min，62°C 1 min，72°C 1min條件下擴增30個循環，最后72°C延伸7 min。
[0010]所述PCR產物與pColdll載體的體積比為7:1。
[0011]所述誘導物為異丙基-β -D-硫代半乳糖苷。
[0012]人類免疫缺陷病毒Vpr蛋白在檢測人類免疫缺陷病毒Vpr抗體中的應用。
[0013]有益效果:
(1)本發明根據Hiv-l Vpr基因序列制備重組蛋白，獲得的重組蛋白純度高、特異性較好、產量豐富。
[0014](2)本發明可以應用于HIV-1 Vpr抗體檢測，以及可溶性Vpr蛋白的功能研究。
【附圖說明】
[0015]圖1 為 HIV-1 Vpr 基因的 PCR 擴增。其中 M:Lammda DNA Marker ;1:以質粒pC1-neo-Vpr為模板的PCR擴增產物。
[0016]圖2為重組原核表達質粒pColdll-Vpr的雙酶切鑒定。M:Lammda DNA Marker ；1:未酶切的pColdll-Vpr質粒；2: pColdll-Vpr質粒的PCR鑒定；3:pColdII_Vpr質粒雙酶切后。
[0017]圖3為不同濃度IPTG誘導Vpr蛋白的表達情況。Μ:蛋白標準參照物；1:未使用IPTG誘導；2:濃度為0.4 mM的IPTG誘導；3:濃度為0.6 mM的IPTG誘導；4:濃度為0.8mM的IP