一種1型鴨甲肝病毒vp4重組蛋白、elisa試劑盒及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種1型鴨甲肝病毒VP4重組蛋白、 ELISA試劑盒及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 鴨甲肝病毒（DuckΗ印atitisAVirus，DHAV)能引起雛鴨爆發鴨病毒性肝炎，其 具有發病急、病程短、傳播迅速、病死率高等特點，臨床上主要表現為食欲減退、神經癥狀、 突然死亡和肝臟腫大出血，又稱歪脖病。目前幾乎遍布世界各個養鴨國家和地區，給養鴨業 帶來了較大的經濟損失。DHAV可分為DHAV-UDHAV-2和DHAV-3三個基因型。DHAV-1為1 型鴨甲肝病毒，是引起鴨病毒性肝炎最主要的一種病原，分布最為廣泛且致病性強、感染率 高，對雛鴨致死率可高達90 %以上。目前幾乎遍布世界各個養鴨國家和地區，給養鴨業帶來 了較大的經濟損失。
[0003] 根據疾病的流行病學特點、特征性臨床癥狀和有診斷意義的剖解病變，一般可做 出初步診斷，但是確診尚需借助實驗室檢測。檢測DHAV的實驗室方法眾多，各有優缺點，中 和試驗是最經典的方法，雖然結果準確，但是操作費時，不適合臨床檢測。RT-PCR技術、環 介導的恒溫擴增技術（LAMP)等一系列分子生物學新技術為該病毒的檢測提供了快捷、高 效的方法。而用于該病抗體檢測的ELISA方法操作簡單，容易掌握，不需要高端精密的儀器 設備，易于推廣。目前針對鴨甲肝病毒抗體檢測的ELISA方法為間接ELISA，但現有的間接 ELISA方法依然存在耗時長、花費大、純化蛋白量小，不能規模化生產。
[0004] 小RNA病毒是RNA病毒中最小的一類，分布極為廣泛，可歸為腸道病毒屬 (enterovirus)、口瘡病毒屬（Aphthovirus)、心病毒屬（Cardiovirus)、嗜肝病毒屬 (Hepatovirus)、副腸孤病毒屬（Parechovirus)、馬鼻病毒屬（Erbovirus)、嵴病毒屬 (Kobuvirus)、捷申病毒屬（Teschovirus)、禽肝炎病毒屬（Avihepatovirus)等。小RNA病 毒呈圓形，病毒粒子直徑為20~40nm，無囊膜，病毒的結構蛋白（衣殼蛋白）一般包括VP1、 VP2、VP3和VP4。其中VP4埋在粒子內部，處于蛋白外殼的內部與基因組RNA相連接。VP1、 VP2、VP3暴露在病毒表面，組成一個亞單位。小RNA病毒VP4蛋白在生理溫度下的向外暴露 與病毒顆粒吸附細胞膜時發生的構象改變有直接的聯系，VP4蛋白在病毒毒粒吸附細胞膜 之后可能參與了病毒進入細胞過程有關的相關事件。小RNA病毒的蛋白外殼具有很強的自 身動態變化，而不是像晶體結構圖所反映的那樣處于一個靜止狀態。抗體與病毒結構構象 關系的研究對理想疫苗的設計及更好地預防小RNA病毒的傳播具有重要意義。但對DHAV衣 殼蛋白的研究相對很少。生物信息學分析和推測表明，DHAV的衣殼蛋白可能為VP1、VP3和 VP0而不是像其他小RNA病毒那樣為VP1、VP2、VP3和VP4,因此DHAV到底是VP0還是VP2 和VP4,他們是否位于暴露在病毒表面及抗原性如何目前未見報道。
[0005] 由此可見，能否對VP4蛋白進行深入研究，基于鴨甲肝病毒的VP4蛋白建立一種重 組蛋白的方法，使得純化獲得的蛋白純度高，并且建立間接ELISA方法，使其敏感性、重復 性及特異性好，操作簡便，可規模化生產成為本領域技術人員亟待解決的技術難題。
【發明內容】
[0006] 本發明為了解決上述技術問題，提供一種1型鴨甲肝病毒VP4重組蛋白、ELISA試 劑盒及其制備方法。
[0007] 本發明技術方案包括以下內容：
[0008] 一種1型鴨甲肝病毒VP4重組蛋白，所述的1型鴨甲肝病毒VP4重組蛋白的氨基 酸序列如SEQIDN0:1所示。
[0009] 一種1型鴨甲肝病毒VP4重組蛋白的制備方法，包括以下步驟：
[0010] 步驟一：獲取VP4目的片段：確定1型鴨甲肝病毒VP4截斷基因酶切位點和特異性 引物，所述上游引物為 5' -GAATTCTACCAGTAGACTTTCATGCAATGG-3'，序列如SEQIDN0:2 所 示，下游引物為 5' -CTCGAGTTGAGCTCCTACTTCATAAGAACA-3 '，序列如SEQIDN0:3 所示，增殖 DHAV-1病毒株，提取DHAV-1病毒株的RNA，利用特異性引物進行RT-PCR擴增，得到VP4目 的片段；
[0011] 步驟二：構建重組表達質粒PET-32C-VP4:將所述VP4目的片段克隆至PMD19-T Simple載體中，加入連接酶，得到連接產物I，將所述連接產物I轉化至感受態細胞中培養， 篩選出陽性克隆體，經鑒定后得到重組質粒PMD19-TSimple-VP4,將所述重組質粒pMD19-T Simple-VP4和表達質粒pET-32c的菌株擴大培養后提取質粒DNA，分別用EcoRI和XhoI 雙酶切、純化回收，將回收得到的VP4目的片段和載體片段pET-32c連接，得到連接產物II， 將所述連接產物II轉化至感受態細胞中培養、篩選出陽性克隆，經鑒定后得到重組表達質 粒pET-32c-VP4;
[0012] 步驟三：制備VP4重組蛋白：重組表達質粒pET-32c-VP4轉化至大腸桿菌BL21中， 進行重組蛋白誘導表達，結束后純化、鑒定，得到1型鴨甲肝病毒VP4重組蛋白。
[0013] 所述步驟二中，VP4目的片段與所述pMD19-TSimple載體的物質的量之比為6:1， 取5μL所述連接產物I加入50μL感受態細胞E.coliDH5α，吹打混勻，冰浴30min后 42°C熱擊60~90s，冰浴lmin，加入LB液體培養基450μL，37°C搖床1. 5h后，經Amp抗性 LB固體和液體培養基篩選陽性克隆。
[0014] 所述步驟二中，所述回收得到的VP4目的片段與載體片段PET-32C的物質的量之 比為6:1，取5μL所述連接產物II加入50μL感受態細胞E.coliDH5α，吹打混勻，冰浴 30min后42°C熱擊60~90s，冰浴lmin，加入LB液體培養基450μL，37°C搖床1. 5h后，經 Amp抗性LB固體和液體培養基篩選陽性克隆。
[0015] 所述步驟二中，所述重組質粒pMD19-TSimple-VP4和重組表達質粒pET-32c-VP4 的鑒定方法均包括菌液PCR鑒定、雙酶切鑒定和測序鑒定，選取所述菌液PCR鑒定正確的陽 性菌液提取質粒DNA，對提取的所述質粒DNA用EcoRI和XhoI進行雙酶切鑒定，選取經菌 液PCR和雙酶切鑒定均正確的菌株進行所述測序鑒定。
[0016] 優選地，所述重組蛋白誘導表達步驟包括：IPTG濃度為0. 6~1. 2mM/L誘導4~ 1211、溫度為37°(：。
[0017] 優選地，IPTG濃度為0· 6mM/L誘導4h。
[0018]優選地，所述步驟三中純化方法為Ni親和層析掛柱純化。
[0019] 上述制備方法中，所述步驟一中的1型鴨甲肝病毒株為1型鴨甲肝病毒Η株，小 RNA病毒科（Picornaviridae)，禽肝病毒屬（Avihepatovirus)，學名為1型鴨甲肝病毒 (DuckHepatitisAVirustype1，DHAV-1)，所述1型鴨甲肝病毒Η株保藏于中國典型培 養物保藏中心，保藏號為CCTCCNO.V201539。
[0020] 一種用于檢測1型鴨甲肝病毒抗體的ELISA試劑盒，包括ELISA板、PBST緩沖液、 封閉液、酶標二抗、顯色液以及終止液，所述ELISA試劑盒還包括權利要求1所述的1型鴨 甲肝病毒VP4重組蛋白。
[0021] 所述的封閉液為含1 %脫脂奶粉的PBS緩沖液；所述的酶標二抗為HRP標記的兔 或羊抗鴨IgG稀釋液。
[0022] -種制備上述ELISA試劑盒的方法，包括以下步驟：
[0023] 步驟一：包被：1型鴨甲肝病毒VP4重組蛋白包被ELISA板，所述VP4重組蛋白的 最佳包被濃度為3. 375μg/ml，100μL/孔，37°C孵育3h后轉入4°C過夜，次日PBST緩沖液 洗板3~5次，每次3min，拍干；
[0024] 步驟二：封閉：加入含1 %脫脂奶粉150 μ L/孔于37°C封閉lh，按照步驟一的方法 洗板，拍干；
[0025] 步驟三：待檢血清孵育：加入1:160稀釋待檢血清，于37°C孵育lh，按照步驟一洗 板，拍干；
[0026] 步驟四：酶標二抗孵育：加入工作濃度的HRP標記的兔或羊抗鴨IgG稀釋液，酶標 二抗稀釋度為1:1600,37°C孵育0. 5h，按照步驟一洗板，拍干。
[0027] 步驟五：顯色：加入TMB顯色液100μL/孔，避光顯色30min;
[0028] 步驟六：終止：加入終止液2mol/LH2S04, 50μ L/孔；
[0029] 步驟七：讀數：用酶標儀以雙波長形式讀取0D45Qnni-0D63Qnni值。
[0030] 本發明的有益效果包括：本發明提供一種1型鴨甲肝病毒VP4重組蛋白、ELISA試 劑盒及其制備方法，成功構建了pET32c(+) -VP4重組原核表達質粒，成功獲得VP4重組蛋白 可溶性表達，并且與兔抗DHAV血清具有良好的反應原性，說明病毒DHAV-1VP4蛋白成功獲 得了原核表達。對DHAV-1的VP4進行原核表達獲得重組蛋白，并以表達的重組蛋白建立了 檢測DHAV-1抗體的間接ELISA檢測方法，建立了檢測1型鴨甲肝病毒抗體的ELISA試劑 盒，建立的ELISA方法具有良好的特異性、重復性及靈敏度，