用于苦柯胺b質量控制中的參比化合物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于醫藥技術領域，具體涉及一種苦柯胺B檢測方法及用于檢測苦柯胺B 中的參比化合物。
【背景技術】
[0002] 苦柯胺B(KukoamineB，化學結構如式1所示）：
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[0004] 天然產物苦柯胺B(KukoamineB)是ShinjiFunayama等首次從地骨皮中分離提 取的生物堿類化合物。苦柯胺B能有效拮抗導致膿毒癥的細菌病原體相關分子一內毒素/ 脂多糖（endotoxin/lipopolysaccharide，LPS)和細菌DNA(CpGDNA)，對治療胺毒癥表現 出良好活性，且作用明顯優于陽性對照藥物，因而具有良好的成藥前景。
[0005] 苦柯胺B的在制備和放置過程中容易因為酸、堿、氧化等條件的改變而使得其有 關物質增高。目前沒有對苦柯胺B雜質的研究，也沒有關于苦柯胺B雜質來源的詳細研究 報道。為了更好的研究苦柯胺B的藥物性質，提高苦柯胺B的藥物質量。實驗人員對苦柯 胺B的有關物質進行了分離、富集、分別收集，然后進行了結構確證。為了能夠獲得更大量 的雜質樣品，實驗人員對其結構進行了分析，然后對其合成路線進行了研究。
[0006] 實驗過程中我們發現，苦柯胺B較不穩定，在無保護的堿性水溶液情況下，極容易 產生大量的雜質。如在較強堿性條件或酰胺水解酶的作用下極容易造成酰胺鍵斷裂，從而 造成多個活性基團的結合。
[0007] 為此，我們對苦柯胺B在生產過程中所產生的雜質進行研究，并根據雜質的特點， 設計一種苦柯胺B的含量檢測方法。
[0008] 中國專利CN201010539028. 4公開苦柯胺B的合成路線如下：
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【發明內容】
[0010] 本發明的目的之一在于，提供一種用于檢測苦柯胺B含量的參比化合物1，其結構 如下：
[0011]
[0012] 本發明還提供參比化合物1的制備方法，合成路線如下：
[0013]
[0014] 具體的，本發明所述參比化合物1的制備方法，包括以下步驟：
[0015] 24.lg化合物0(0.lmol)、31.4ml的三乙胺（0. 22mol)溶于400ml干燥的二氯甲烷 中，將3, 4-二芐氧基苯丙酰氯用干燥二氯甲烷200ml溶解，于冰浴攪拌下緩慢滴入，滴加結 束后，冰浴反應約lh，通過薄層層析監控反應終點，直至反應完全，濃縮有機溶劑，加入稀鹽 酸500ml、乙酸乙酯400mlX3萃取，飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，抽濾，濃縮得粗品， 柱層析，得純品化合物B1。
[0016] 46. 8g化合物B1 (0· 08mol)溶于30ml四氫呋喃中，加入飽和的氨甲醇溶液800ml 和RaneyNi4. 3g，排盡空氣后，約3MPa的氫氣壓力下，于高壓爸中50°C條件下攪拌反應 12 ±2h，通過薄層層析監控反應終點，直至反應完全，抽濾，濃縮得粗品，柱層析，得純品化 合物B2,黃色油狀物。
[0017] 41. 2g化合物B2(0. 7mol)、3L4ml的三乙胺（0· 22mol)溶于400ml干燥的二氯甲 烷中，將3, 4-二芐氧基苯丙酰氯用干燥二氯甲烷200ml溶解，于冰浴攪拌下緩慢滴入，滴加 結束后，冰浴反應約lh，通過薄層層析監控反應終點，直至反應完全。濃縮有機溶劑，加入 稀鹽酸500ml、乙酸乙酯400mlX3萃取，飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，抽濾，濃縮得粗 品，柱層析，得純品化合物B3。
[0018] 93. 3g化合物B3 (0·lmol)溶于600ml二氯甲烷中，室溫攪拌下緩慢加入300ml飽 和的鹽酸乙醚溶液，冰浴下反應6±2h，通過薄層層析監控反應終點，直至反應完全，濃縮， 抽濾，得產物化合物B4。
[0019] 66. 6g化合物Μ(0· 08mol)溶于400ml甲醇中，室溫攪拌下滴入丙烯腈 (13.6ml，0. 20mol)的甲醇（100ml)溶液，滴加結束后，室溫反應5±2h，通過薄層層析監控 反應終點，直至反應完全。濃縮得化合物B5。
[0020] 62g化合物B5(0. 7mol)、77ml的三乙胺（0. 22mol)溶于400ml干燥的二氯甲烷中， 將3, 4-二芐氧基苯丙酰氯用干燥二氯甲烷200ml溶解，于冰浴攪拌下緩慢滴入，滴加結束 后，冰浴反應約lh，通過薄層層析監控反應終點，直至反應完全。濃縮有機溶劑，加入稀鹽酸 500ml、乙酸乙酯400mlX3萃取，飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，抽濾，濃縮得粗品。柱 層析，得純品化合物B6。
[0021] 61. 5g化合物B6(0. 05mol)溶于60ml四氫咲喃中，加入飽和的氨甲醇溶液800ml 和RaneyNi4. 3g，排盡空氣后，約3MPa的氫氣壓力下，于高壓爸中50°C條件下攪拌反應 12±2h，通過薄層層析監控反應終點，直至反應完全。抽濾（硅藻土助濾），濃縮得粗品，柱 層析，得純品化合物B7，黃色油狀物。
[0022] 49g化合物B7((X04mol)、7ml的三乙胺（0· 044mol)溶于200ml干燥的二氯甲烷 中，將3, 4-二芐氧基苯丙酰氯用干燥二氯甲烷200ml溶解，于冰浴攪拌下緩慢滴入，滴加結 束后，冰浴反應約lh，通過薄層層析監控反應終點，直至反應完全。濃縮有機溶劑，加入稀鹽 酸200ml、乙酸乙酯400mlX3萃取，飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，抽濾，濃縮得粗品。 柱層析，得純品化合物B8。
[0023] 47g化合物B8(0.03mol)溶于30ml四氫呋喃中，加入700ml甲醇，4.8g10%鈀/ 碳后，排盡空氣，氫氣常壓下室溫反應15±2h，通過薄層層析監控反應終點，直至反應完全。 過濾，真空干燥得化合物1。
[0024] 本發明的目的之一在于，提供一種用于檢測苦柯胺B含量的參比化合物2,其結構 如下：
[0025]
[0026] 本發明還提供參比化合物2的制備方法，合成路線如下：
[0028] 具體的，本發明所述參比化合物2的制備方法，包括以下步驟：
[0029] 12g化合物B7(0.01mol)溶于10ml四氫呋喃中，加入100ml甲醇，1.2g10%鈀/ 碳后，排盡空氣，氫氣常壓下室溫反應15±2h，通過薄層層析監控反應終點，直至反應完全。 過濾，真空干燥得化合物2。
[0030] 本發明的目的之一在于，提供一種用于檢測苦柯胺B含量的參比化合物3,其結構 如下：
[0031]
[0032] 本發明還提供參比化合物3的制備方法，合成路線如下：
[0033]
[0034] 具體的，本發明所述參比化合物3的制備方法，包括以下步驟：
[0035] 38g化合物C2 (0.lmol)、15. 7ml的三乙胺（0.llmol)溶于200ml干燥的二氯甲烷 中，將0.ImoICBZCl用干燥二氯甲烷200ml溶解，于冰浴攪拌下緩慢滴入，滴加結束后，冰浴 反應約lh，通過薄層層析監控反應終點，直至反應完全。濃縮有機溶劑，乙酸乙酯400ml萃 取，無水硫酸鈉干燥，抽濾，濃縮得粗品。柱層析，得純品化合物C3。
[0036] 51. 3g化合物C3 (0.lmol)溶于100ml二氯甲烷中，室溫攪拌下緩慢加入300ml飽 和的鹽酸乙醚溶液，冰浴下反應6±2h，通過薄層層析監控反應終點，直至反應完全。濃縮， 抽濾，得產物化合物C4。
[0037] 33g化合物C4(0. 08mol)溶于100ml甲醇中，室溫攪拌下滴入丙烯腈 (13.6ml，0. 20mol)的甲醇（100ml)溶液，滴加結束后，室溫反應5±2h，通過薄層層析監控 反應終點，直至反應完全。濃縮得化合物C5。
[0038] 28g化合物C5(0. 06mol)、3L4ml的三乙胺（0· 22mol)溶于400ml干燥的二氯甲 烷中，將0. 06m〇13, 4-二芐氧基苯丙酰氯用干燥二氯甲烷200ml溶解，于冰浴攪拌下緩慢滴 入，滴加結束后，冰浴反應約lh，通過薄層層析監控反應終點，直至反應完全。濃縮有機溶 劑，加入稀鹽酸500ml、乙酸乙酯400mlX3萃取，飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，抽濾， 濃縮得粗品。柱層析，得純品化合物C6。
[0039] 48g化合物C6(0. 06mol)溶于40ml四氫呋喃中，加入飽和的氨甲醇溶液800ml 和RaneyNilOg，排盡空氣后，約3MPa的氫氣壓力下，于高壓爸中50°C條件下攪拌反應 12±2h，通過薄層層析監控反應終點，直至反應完全。抽濾，濃縮得粗品。柱層析，得純品化 合物C7,黃色油狀物。
[0040] 8.lg化合物C7(0.01mol)溶于10ml四氫呋喃中，加入100ml甲醇，lg10%鈀/碳 后，排盡空氣，氫氣常壓下室溫反應15 ± 2h，通過薄層層析監控反應終點，直至反應完全。過 濾，真空干燥得化合物3。
[0041] 本發明的目的之一在于，提供一種用于檢測苦柯胺B含量的參比化合物4,其結構 如下：
[0042]
[0043] 本發明還提供參比化合物4的制備方法，合成路線如下：
[0044]
[0045] 具體的，本發明所述參比化合物4的制備方法，包括以下步驟：
[0046] 35. 4g化合物B2(0. 06mol)、3L4ml的三乙胺（0· 22mol)溶于 400ml干燥的二氯 甲烷中，將0. 06molCBZCl用干燥二氯甲烷200ml溶解，于冰浴攪拌下緩慢滴入，滴加結束 后，冰浴反應約lh，通過薄層層析監控反應終點，直至反應完全。濃縮有機溶劑，乙酸乙酯 400ml萃取，無水硫酸鈉干燥，抽濾，濃縮得粗品。柱層析，得純品化合物D1。
[0047] 72. 4g化合物C3 (0.lmol)溶于100ml二氯甲烷中，室溫攪拌下緩慢加入300ml飽 和的鹽酸乙醚溶液，冰浴下反應6±2h，通過薄層層析監控反應終點，直至反應完全。濃縮， 抽濾，得產物化合物D2。
[0048] 50g化合物D2 (0. 08mol)溶于100ml甲醇中，室溫攪拌下滴入丙烯腈 (13.6ml，0. 20mol)的甲醇（100ml)溶液，滴加結束后，室溫反應5±2h，通過薄層層析監控 反應終點（硅膠板：GF254，展開劑：二氯甲烷：甲醇=10:1)，直至反應完全。濃縮得化合物 D3〇
[0049] 41g化合物D3 (0. 06mol)、31. 4ml的三乙胺（0. 22mol)溶于400ml干燥的二氯甲 烷中，將0. 06m〇13, 4-二芐氧基苯丙酰氯用干燥二氯甲烷200ml溶解，于冰浴攪拌下緩慢滴 入，滴加結束后，冰浴反應約lh，通過薄層層析監控反應終點，直至反應完全。濃縮有機溶 劑，加入稀鹽酸500ml、乙酸乙酯400mlX3萃取，飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，抽濾， 濃縮得粗品。柱層析，得純品化合物D4。
[0050] 61g化合物D4(0. 06mol)溶于40ml四氫呋喃中，加入飽和的氨甲醇溶液800ml 和RaneyNilOg，排盡空氣后，約3MPa的氫氣壓力下，于高壓爸中50°C條件下攪拌反應 12±2h，通過薄層層析