用于dna和rna檢測的雙探針：反探針組合物的制作方法
【專利說明】用于DNA和RNA檢測的雙探針:反探針組合物
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本國際申請根據37 C.F.R.§ 1.119(e)要求2013年3月26日提交的美國臨時申請序列號61/805，272的優先權權益，該臨時申請現已放棄，該臨時申請的全部內容通過引用并入本文。
[0003]發明背景
[0004]應用范圍
[0005]本公開涉及核酸探針技術領域，特指用于鑒定和定量分析目標DNA或RNA序列的復合物及方法。尤其是在擴增過程中或擴增后，用以標記及檢測有科學意義及臨床意義的正常或突變靶序列。
[0006]相關技術的描述
[0007]通常運用雜交的方法，將標記的DNA探針與感興趣的靶基因結合來檢測目的基因的核酸序列。為了獲得好的檢測結果，在雜交后必須對雜交產物進行清洗以去除未結合及非特異性結合的探針。然而，在實時定量PCR的過程中(美國專利4965188 ;美國專利5210015 ;美國專利5487972 ;美國專利5538848)，無法進行洗滌。因此，必須設計出新的探針，這種探針與目的基因結合的時候，能選擇性的發出信號。而當他們未結合或者游離在溶液中時，信號減弱或者淬滅。曾經使用過一種探針來達到這一目的。該探針能夠在供體分子和受體分子之間，諸如兩個焚光之間或焚光劑和淬滅劑之間，激發并轉移焚光能量。(Didenko V，2001，B1techniques 31:1106-1116,1118,1120-1121 ；Chen et al.,1997,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 30:94:10756-10762)。供體的熒光發射譜與受體的吸收或激發譜重疊，當受體和供體距離比較近時(10-100angstroms)，供體的激發態能量就轉到受體分子上，這時，如果受體分子為熒光劑，就能激發長波長的信號。但如果受體分子為淬滅劑，熒光信號會顯著減少甚至消失。
[0008]TAQMAN.RTM和分子信標探針常用于實時定量PCR檢測。這兩種探針都能作為內部探針，與一對引物結合，而這對引物又分別與目的基因序列側翼結合。引物擴增靶基因片段，而探針選擇性結合到一個標識序列之間，從而導致熒光信號增加。盡管這些探針的作用相似，但它們的檢測機制不同。
[0009]TAQMAN.RTM探針由短的寡核苷酸構成，該寡核苷酸與靶序列互補。探針尾部標記熒光供體和受體(美國專利5538848)。通常熒光團例如熒光素與更長波長的熒光團(例如TAMRA的。R商標)或非熒光淬滅劑，如BLACK HOLE QUENCHER.RTM,配對。雖然TAQMAN:RTM專利已經過期，但仍然為實時PCR探針的主要技術。
[0010]分子信標探針也是利用熒光相互作用來檢測PCR產物(美國專利5925517 ;Tyagiet al., 1996, Nat.B1technology 14:303-308)，但是，該探針的末端包含短互補序列，這些序列相互結合形成頸環結構。在此猝滅劑和熒光標記的末端距離很近，從而抑制熒光的產生。
[0011]SCORP1N.RTM探針的檢測機制也是發夾機制，不同的是該探針還具有spacer ?并連接一段引物(Whitcombe et al，1999 年，Nat.B1technol.17:804-80 7;美國專利6，326，145)。在未雜交時該探針保持熒光淬滅的發夾結構，但發生變性，退火，并與模板結合后，發夾結構打開，熒光信號得以釋放。
[0012]類似于SCORP1N.RTM, SUNRISE.RTM探針包含一段引物，該引物連接于發夾探針上，該探針擴增時延伸。這樣就將淬滅劑同5’端的焚光劑分開(Nazarenko et al., 1997,Nucl.Acids Res.25:2516-2521)。
[0013]其它實時PCR探針包括:(a)雙雜交探針(Wittwer et al.，1997，B1Techniques22:130-138)。該探針涉及兩個和模板互補且相連的熒光探針。其原理是兩個相鄰標記物之間熒光能量的轉移；以及(b) LUX引物探針(Kusser，2006，Methods Mol.B1l.335:115-133) o該引物對中的一個引物:V端用熒光團標記。該引物自身折疊并與引物5’端的短序列互補，使熒光淬滅。的引物自猝滅通過折疊和結合到短互補序列已被附加到5'引物序列?ΕΜΕ的末端。
[0014]傳統的雙標探針在設計上要有選擇性，并且價格昂貴，合成起來非常困難。合成后需要手工加入至少一種標記物并要求高壓液相色譜純化。TAQMAN.RTM和分子信標探針需要兩個結合在探針兩端的反向引物。為了在退火階段有效發揮功能，TAQMAN.RTM和分子信標探針必須更長，Tm(熔融溫度)比引物的Tm高5至10度，因為在延伸之前探針必須牢固結合在靶基因上。這些就導致難以設計和開發檢測SNP(單核苷酸多態性)或單堿基突變的雙熒光探針。因此，假陽性是一個共同的問題困難。
[0015]FISH(熒光原位雜交)的探針技術需要:1)標記的DNA探針，2)探針雜交到已固定的變性靶標上，3)嚴格洗滌未結合的探針，和4)熒光的激發和檢測(Barch M.J, editor.The ACT Cytogenetics Laboratory Manual 2nded.New York:Raven Press ;1991)。
[0016]基因芯片檢測類似FISH檢測。通常將寡核苷酸cDNA探針排列在載體基質上。將靶基因DNA或RNA用熒光標記后與探針雜交；經嚴格洗滌后進行檢測，通常由激光掃描儀來檢測(Schena et al.，(1995) Science270:467-470 ；Heller et al.，(1997) Proc.Natl.Acad.Sc1.US.A.94:2150-2155)。與FISH技術相同，洗步驟復雜且耗時。更重要的是，準備和標記目的基因的價格昂貴，因為每個樣本都是是獨一無二的，因此，基于微陣列的檢測技術在臨床診斷上價值有限。
[0017]因此需要更有效和更可靠的探針來檢測核酸。由于qPCR法容易出現假陽性和陰性，因此當這種技術應用于臨床分子診斷時，可能導致對病人制定有害的治療方案。尤其是當前的技術在多探針系統中還存在缺陷。多探針系統通過在一個分析系統中同時檢測2個或者更多個診斷靶序列來彌補假陰性和假陽性的缺陷。本項發明能夠滿足這些長遠的需求。
[0018]摘要
[0019]本發明提供的探針系統適合于實時和終點檢測DNA或RNA序列，包括區分單個堿基變異，如SNP和點突變的探針。本公開中主要包括有效用于實時定量PCR(qPCR的)的探針系統。實時定量PCR就是將小片段基因以指數擴增，在擴增期間其頻度由熒光信號來檢測。本公開也提供多探針方法。在一個分析中聯合使用2個或多個探針，靶向一個物種或基因中的兩個或更多個標識序列，以改善檢測的確定性和/或信號容量。當檢測一個擴增子中兩個或更多序列時，該技術就更有使用價值了。此外，本發明提供多探針系統的診斷成分。由于多探針系統在一個分析中檢測多個相關目的序列中的優勢，而在診斷特定疾病和癌癥方面有更高的敏感性和可信賴性。這些探針系統可應用于研究，生物藥學及生命科學中各種不同的方面。
[0020]尤為特別的是，目前的發明直指多探針系統，以改善實時定量PCR及其他擴增方法中檢測一個屬種，一個基因或者其他相關核酸靶序列時的熒光信號或者檢測的可靠性。該探針系統包括:(1)兩個或者多個與樣本中2個或多個相關的標識序列互補的探針。探針與信號放大器有相同的標記物，或者不同的標記物以明確檢測，或者同時有相同和不同的標記物。探針包含一個或多個探針:反探針系統，其從含有iDDS探針，iDDS-2Q探針，MacMan探針，Flip 探針，通用探針(Universal probes)，半通用探針(Half-Universal probes),ZIPR探針，和G-Force探針中選取。多探針系統也包括(2)兩側引物成分，包括2個引物，一個引物或一個引物探針，或者兩個引物探針。
[0021]本發明也指向一個相關的多探針系統，包含一個或多個可替換的探針，這些探針來自 TaqMan 探針，分子信標探針(Molecular Beacon probes), Scorp1n 探針，LUX 探針，Sunrise探針和雙雜交探針(Dual Hybridizat1n probes)。多探針系統中的探針可以被可替換探針所替代。
[0022]本發明也明確改善檢測信號和/或檢測可靠性的方法。這個方法包括獲得人體，動物或者生物標本，用標記的探針接觸生物標本，兩側引物的成分，當生物樣本與標記探針結合時，檢測標記物釋放的信號。如果標記的探針包含相同的標記物時，信號被放大，改善了檢測信號的強度。如果探針標記物不同，那么能對檢測結果進行驗證，因此改善了檢測的可靠性，同樣，如果同時標記相同或不同標記物時，能同時增加檢測信號的強度和檢測可靠性。
[0023]簡要描述
[0024]圖1.系統解釋例1中的多探針系統，包括2個iDDS_2Q探針:同時應用反探針系統來靶向檢測糞腸球菌中的vanA基因。一個探針(P1-2Q)靶向反義序列，另一個探針(P2-2Q)靶向正義序列。黑色圓形代表吸收熒光的淬滅劑。灰白色圓形代表不同顏色的熒光發射分子。在這一組合中，與雙探針結合的2個模板序列位于模板兩端引物標記的序列之內。在傳統的雜交條件下，在qPCR的退火階段，雙淬滅劑標記的探針(iDDS_2Q)首先與完全匹配的模板結合，從而釋放熒光信號。淬滅劑標記的反探針(API和AP2)的作用是阻止探針與錯誤匹配的模板結合。為達到這一目的，這種反探針將關閉那些沒有正確結合到靶基因上的探針。另外，探針3’端上的第二淬滅劑也能消除所有未結合到靶基因上的探針的信號，從而進一步減少背景信號。因此，這些探針提供高敏感性熒光信號，并通過同時平行檢測2個相關的靶標序列而不斷驗證檢測的準確性。
[0025]圖2.顯示的是利用特異性iDDS_2Q探針對耐萬古霉素的糞腸球菌vanA基因進行qPCR擴增所產生的熒光信號曲線圖(參見圖1中的方案1)。該曲線圖來自于兩個管子中樣本的擴增。每管都有兩個vanA探針。第一管是vanA陽性模板，曲線1和曲線2顯示第一管樣本的擴增和陽性信號圖。第二管是vanB對照模板，兩條扁平曲線表明檢測不到vanB的擴增。需要注意vanA探針1標記由橘色焚光(CalFluor0range560)，vanA探針2標記為紅色熒光(CalFluorRed610)，探針1發出的信號高于探針2發出的信號。然而，2個陽性信號通常在qPCR循環中相同的時間點開始升高，因此他們的CT值相同。大部分qPCR儀器，通過調整其獲得設置來平衡不同熒光發出的信號水平。在這種獲得性調整的基礎上進行大規模的驗證性研究。即采用vanA雙探針對182例院內標本進行檢測以篩查vanA感染情況。結果是:采用雙iDDS-2Q探針準確檢測出24例陽性標本，用CT值檢測的iDDS_2Q雙探針的陽性信號是相同的。儀器檢測的CT值相當接近(均差?0.32CT，大多數變種?0.6CT的差異)，又驗證了這一結論。
[0026]圖3示出在一個管內加入雙iDDS_2Q探針通過qPCR生成的熒光曲線的另一個示例(類似于圖1的方案)；在這種情況下，由一對引物擴增這兩個探針位點。同樣，兩個探針標有不同的顏色的熒光，并且靶向陰道毛滴蟲(T.vag.)重復性DNA序列中相鄰的標識序列。陰道毛滴蟲的檢測是該類感染性疾病的診斷基礎。曲線1和2表示含有T.vag陽性標本的2個陽性探針信號，而兩個平曲線來自于含有人類基因組DNA的第二管對照樣品。同vanA的測定相同，陽性曲線的高度不同，但CT值基本相同。在另一個大規模病例(η = 186)的驗證研究中，27例樣本中發現T.vag,且CT值僅差0.3CT (最大差異0.6)。雙iDDS_2Q法的檢測敏感性是標準顯微鏡下“液體涂片”的3倍，傳統方法僅測出9例陽性標本。
[0027]圖4A顯示使用雙iDDS_2Q探針的qPCR熒光曲線。該雙探針特異性針對(a) EGFR21外顯子L858R突變位點，或者(b)野生EGFR L858位點序列。每個探針標記不同熒光。曲線1顯示用突變特異性探針檢測含有100% L858突變樣本的檢測情況。盡管2中探針使用相同的引物對，但野生型探針(曲線2)并沒有給出假陽性信號。因此，這種雙探針法可明確分辨單堿基的差異。
[0028]圖4B示qPCR熒光圖譜。所用探針與圖4A相同，但所用儀器不同。在這種情況下，在一個管子內將野生型EGFR和L858R突變型EGFR模板按50/50混合后，加入雙探針上機運行檢測。陽性曲線1和2在角度及高度上非常相似，而2個平坦曲線為完全相同的2個探針在以水為對照管的第二管中的檢測情況。
[0029]圖5A顯示使用特異于野生型人類EGFR的雙iDDS_2Q探針通過qPCR產生熒光曲線。探針1檢測與肺癌相關的19號外顯子的突變情況，探針2檢測EGFR19號外顯子缺失位點上游的參考序列的。每個探針標記不同的熒光，并且，他們在一個側引物對標記的序列內。這是一個反向檢測突變頻率的方法，因為普通的探針不能檢測靶基因上多個不同的缺失。探針1只檢測野生型19號外顯子，不能檢測19號外顯子缺失突變。已知與癌癥相關的19號外顯子通常表現為15號堿基的缺失，但9-24號堿基都有可能缺失。探針2，參考探針，檢測EGFR所有擴增子，不管有無19號缺失。因此，探針1與探針2之間的信號比例就反映了樣本中有19號外顯子缺失的相對量。在圖示樣本中，雙探針檢測的是一個100%野生型EGFR樣本，因此兩條曲線是并行的。
[0030]圖5B顯示使用與圖5A相同的探針通過qPCR產生兩條熒光曲線。在這種情況下，反應體系中包含以50/50混合的野生型EGFR和19號缺失的EGFR模板。因此野生型樣本的曲線較參考曲線低50%。此法能容易的檢測含20-50% EGFR突變細胞的病人樣本。
[0031]圖5C.顯示使用與圖5A相同的探針通過qPCR產生兩條熒光曲線。在這種情況下，反應體系中含有100%的EGFR缺失突變的模板。參考探針，探針1只正向檢測EGFR缺失突變體模板，盡管突變體序列存在。與此相反，探針2顯示了一個平坦的曲線，表示所有的擴增子都有突變，在診斷性突變位點上沒有發現野生型序列。
[0032]圖.6所示的使用兩個探針對腸道病毒有診斷意義的5'非編碼區(UTR)的1DDS-2Q探針，通過qPCR產生兩種熒光曲線。將探針末端連接一對引物，這兩對引物在靶序列上部分重疊，分別檢測正義鏈和反義鏈。陽性曲線1和2反映的是用雙探針對一個管中EV陽性樣本的檢測結果。兩條平坦曲線反映的是用兩個EV探針對另一個管中人類基因組DNA對照樣品的檢測情況。
[0033]圖.7所示的使用特異于副腸孤病毒(parechovirus)的有診斷意義的5'非編碼區(PV)的兩個2iDDS_2Q探針，通過qPCR產生兩種熒光曲線。曲線1，2反映用兩個探針檢測一個管中PV陽性樣品的信號。兩平坦曲線反映的是用兩個PV探針在另一個管中檢測人類基因組DNA對照樣品的檢測情況。
[0034]本公開中涉及的方法和系統的一些示例將在下面詳細描述。通過檢測本公開中描述的內容，圖譜，實例及聲明，本領域技術人員可對本發明的其他特征，目的，和優點了如指掌。它意在將所有其他系統，方法，特征和優點被包括在本說明書內，包括在本公開的范圍內，并且由所附的權利聲明來保護。
[0035]公開的詳細描述
[0036]在參考文獻中包含了本描述中引用的所有文獻，專利及專利使用。但是應當理解的是，本公開并不限于所描述的特定實例，也不局限于所描述的方法和使用的材料，并且，由于該公開的使用范圍僅受權利聲明的限制而導致內容和方法有所不同。這里描述的每一個實例都其獨特特征，這些特征可能與其他實例的特征不同或者相聯系，但并不違背該公開的精神和范圍。所有引用的方法可按照引用事件的順序實施，或者以任何邏輯上可行的順序實施。除非另有定義，否則這里所用的所有術語與分子生物學領域中普通技術人員所理解的含義相同。這也是可以理解的是，本文所使用的術語僅用于描述具體實施方案的目的，并且不旨在進行限制，因為本公開的范圍將由所附的權利要求來限定。
[0037]下列縮寫:iDDS，內部的DNA檢測開關；qPCR，定量PCR(實時PCR) ;LNA，鎖核酸；BNA，橋連核酸；Tm，解鏈溫度；SNP，單核苷酸多態性；CT，循環閾值。
[0038]術語“一”，與術語“包括”在要求和/或說明書中一起使用時，可以指“一”，但也可指“一個或多個”，“至少一個”，以及“一個或一個以上的”。本發明的一些實例可以包括或基本上包括一個或多個元件，組件，方法步驟，和/或本發明的方法。可以預期的是任何方法，化合物，組合物，系統，或本文描述的設備可相對于任何其他方法，化合物，組合物，系統，或在本文描述的設備中實現。
[0039]術語“或”，在聲明中是指“和/或”，除非明確“or”僅指替代或替代品與原品是相互排斥的。公開支持“or”僅指替代品，以及使用“和/或”。
[0040]術語"大約” 一詞是指一個數量值，無論是否明確指出，其包括整數，分數和百分數。術語“約”通常是指一個數值范圍，例如，所引用的數值的+/-5-10%，即在本領域的普通技術人員將認為等同于所引用的數值，例如，具有相同的功能或結果。在一些情況下，術語“約”可包括四舍五入為最接近的數字.
[0041]術語“DNA擴增”和“擴增”是指任何通過酶擴增增加一個特定的DNA序列拷貝的方法。通常使用的方法是如美國專利號4，683，195和4，683，202中描述的聚合酶鏈反應(PCR)。
[0042]這里使用的“聚合酶鏈反應”和“PCR”是指在聚合酶的催化下以熱循環的方式進行DNA擴增反應。DNA擴增反應需要核酸，與模板互補的寡核苷酸引物，熱穩定性DNA聚酶，脫氧核糖核苷酸。
[0043]術語“qPCR”是指在PCR擴增過程中運用引物和標記的探針同時檢測每個步驟產生的目的DNA分子數量的一種實時聚合酶鏈反應。
[0044]本文所用的術語“引物”指與被擴增或復制的DNA或RNA模板互補的寡核苷酸。引物與模板序列雜交或退火，并通過聚合酶來啟動復制/擴增過程。
[0045]本文所用的術語“探針”是指長度可變的寡核苷酸。通過與靶基因雜交來檢測相同，相似或互補的核酸序列。寡核苷酸探針通常被標記上可檢測的物質如放射性，熒光或化學發光化合物。
[0046]本文所用的術語“熒光團”是指可以通過其發光特性而被檢測到的任何報告基團。
[0047]本文所用的術語“淬滅劑”是指一種分子，它能夠干擾或吸收由附近熒光團發射的熒光。
[0048]術語“互補”是指兩個序列段之間有足夠數量的匹配堿基存在，以便它們可以特異性結合或雜交。
[0049]術語“變性”是指通過熱或變性劑處理，使雙鏈DNA分離成為互補DNA單鏈。
[0050]本文所用的術語“雜交”是指兩個核酸鏈通過氫鍵結合形成穩定的反向平行的雙鏈體的過程。雜交鏈被稱為“雙鏈”。
[0051]術語“雜交親和力”是指兩個核酸片段間的化學親和程度，取決于匹配的堿基對之間的結合，而雜交親和力根據雙鏈體的長度和序列的不同而有所變化。
[0052]本文所用的術語“錯配堿基”是指在一個雙鏈中，其中一個或多個反向核苷酸堿基與互補鏈不匹配。不匹配可能由于添加，缺失，或取代天然或非天然堿基，或間隔。
[0053]本文所用的術語“靶”和“靶核苷酸序列“是指期望檢測的多核苷酸序列。
[0054]本文所用的術語“標簽序列”是指一段靶核苷酸序列，該序列用以識別感興趣的一個基因，物種，或有機體。
[0055]本文所用的術語“探針:反探針”指的是一對寡核苷酸序列，他們具有接近或者