含有海藻糖及葡聚糖的哺乳動物細胞移植用溶液的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及：在含有2. 0~6. 0(w/v) %的海藻糖或其衍生物或它們的鹽（以下有 時稱為"海藻糖類"）、和4. 0~7. 0(w/v) %的葡聚糖或其衍生物或它們的鹽（以下有時稱 為"葡聚糖類"）的細胞移植用生理性水溶液（以下有時稱為"本申請的細胞移植用溶液"） 中保存哺乳動物細胞的方法；本申請的移植用溶液；和含有移植用細胞的生理性水溶液， 其含有哺乳動物細胞、和海藻糖類及葡聚糖類。
【背景技術】
[0002] 近年來，由于干細胞研究的迅速發展，向再生醫療中應用的形勢高漲，其知識和理 解不僅在研究者中、在普通人中也得到了廣泛普及。使用干細胞的再生醫療是以利用干細 胞所具有的自復制能力和多分化能力、干細胞分泌的因子來恢復因各種疾病而受到損傷的 細胞和組織的功能為目的的醫療。若對白血病、再生不良性貧血等血液疑難病患者進行骨 髓移植，造血干細胞在患者體內成活，在幾乎一生內維持造血能力成為可能。此外，近來很 多研究者以使用除造血干細胞以外的干細胞的臨床應用為目標，對中樞神經、末梢神經、骨 髓、小腸等中的干細胞進行鑒定，已開始實踐針對外傷性疾病和組織變性疾病進行組織干 細胞移植治療（非專利文獻1~3)。另一方面，癌癥免疫細胞療法是將具有攻擊癌癥的功 能的免疫細胞取出至體外、強化其功能后再次移植回體內的最先進的細胞醫療，并已實踐 了樹突狀細胞疫苗療法、α β T細胞療法、γ δ T細胞療法、CTL療法、自然殺傷細胞療法（NK 細胞療法）等利用Τ細胞的療法。
[0003] 在長期保存用于移植治療中的干細胞、Τ細胞時，通過在液體中的保存，無法良好 地維持細胞存活率。例如，已有報道稱將人骨髓干細胞在生理鹽水中冷藏保存（4°C)時， 細胞存活率在48小時后降低至40%以下，在72小時后降低至20%以下（非專利文獻4)。 因此，長期保存移植用干細胞、移植用T細胞時，一般進行冷凍保存。但是，由于在冷凍保存 液中通常添加有DMS0、甘油等冷凍保存劑，因此，將經冷凍保存的干細胞、T細胞解凍之后， 需要在進行移植治療之前除去移植冷凍保存劑，存在耗費勞力的問題。另外，即使在冷凍保 存液中添加冷凍保存劑，冷凍時的水的結晶化對細胞骨架的損傷也大，凍融后的細胞存活 率降低也成為問題。因此，當務之急是開發出簡便性優異、且能夠抑制細胞存活率的降低的 細胞保存液。
[0004] 另一方面，海藻糖（trehalose)為葡萄糖以1，1-糖苷鍵鍵合而成的二糖之一。海 藻糖呈甜味、且具有高的保水力，因此被用于各種食品、化妝品中。此外，海藻糖具有使細胞 膜穩定、抑制細胞損傷的性質，因此被用作移植器官時的器官保護液的有效成分。例如，已 研制了 ET-Kyoto液、New ET-Kyoto液等含有海藻糖的優異的器官保存液（專利文獻1及 2,非專利文獻5)。
[0005] 葡聚糖（dextran)是由葡萄糖形成的多糖類之一，作為增稠劑、保濕劑等廣泛應 用于醫藥品、化妝品領域中。
[0006] 本申請的發明人已經報道了使用含有海藻糖的生理性水溶液清洗通過蛋白質分 解酶處理從細胞培養容器中剝離的間充質干細胞時，間充質干細胞的細胞死亡受到抑制 (專利文獻3)。當由于蛋白質分解酶處理而導致細胞受到損傷時，細胞死亡（細胞凋亡等） 的途徑將被誘導，故而可以認為，上述由海藻糖帶來的效果是基于細胞凋亡途徑被抑制或 細胞損傷的修復功能被促進而產生的。另外，本申請的發明人還報道了在間充質干細胞的 懸浮液中添加海藻糖、葡聚糖等糖類時，可以抑制短時間（30分鐘~6小時）保存時的間充 質干細胞的凝集、存活率的降低（專利文獻4)。但是，通過并用海藻糖和葡聚糖，是否能夠 協同性地抑制間充質干細胞等哺乳動物細胞的細胞存活率降低、并協同性地提高活細胞的 比例尚不明確。
[0007] 現有技術文獻
[0008] 專利文獻
[0009] 專利文獻1 :日本專利第3253131號公報
[0010] 專利文獻2 :國際公開第2007/043698號小冊子
[0011] 專利文獻3 :國際公開第2012/133575號小冊子
[0012] 專利文獻4 :日本特開2012-115253號公報
[0013] 非專利文獻
[0014] 非專利文獻 1 :Gage，F.H. Science 287:1433-1438(2000)
[0015] 非專利文獻 2 :Morrison, S. J. et al.，Cell 96:737-749(1999)
[0016] 非專利文獻 3 :Batle，E. et al.，Cell 111:251-263(2002)
[0017] 非專利文獻 4 :Lane, T. A. et al·，Transfusion 49:14了1-1481 (2〇〇9)
[0018] 非專利文獻 5 :Chem，F.et al.，Yonsei Med. J. 45:1107-1114 (2004)
【發明內容】
[0019] 本發明的課題在于提供能夠有效地抑制保存哺乳動物細胞時的細胞死亡的細胞 移植用溶液、和使用所述細胞移植用溶液長期保存哺乳動物細胞的方法。
[0020] 如上文所述，本申請的發明人已報道了在添加有海藻糖、葡聚糖等糖類的溶液中 短時間（30分鐘~6小時）地保存間充質干細胞時，能夠抑制細胞存活率降低（專利文獻 4)。但是，專利文獻4記載的發明中，并未顯示通過并用海藻糖與葡聚糖而產生的協同效 果。在為解決上述課題而反復進行深入研究的過程中，本申請的發明人發現，如果在生理性 水溶液中添加海藻糖及葡聚糖使得其成為特定的濃度（分別為2. 0~6. 0 [w/v] %及4. 0~ 7. 0 [w/v] % )，將人骨髓間充質干細胞（hMSC-BM)、人末梢血T細胞（hPBT)保存在該溶液中 時，可以長期（至少14天）協同性地抑制細胞存活率降低，并可以協同性地提高活細胞的 比例，從而完成了本發明。
[0021] 即，本發明涉及：（1)在下述細胞移植用生理性水溶液中保存哺乳動物細胞的方 法，所述細胞移植用生理性水溶液含有2. 0~6. 0(w/v) %的海藻糖或其衍生物或它們的 鹽、和4.0~7.0 (w/v) %的葡聚糖或其衍生物或它們的鹽；（2)如上述（1)所述的方法，其 特征在于，生理性水溶液選自由乳酸林格液、生理鹽水、林格液及乙酸林格液組成的組；（3) 如上述（1)或（2)所述的方法，其特征在于，在細胞移植用生理性水溶液中將哺乳動物細胞 保存3~14天；(4)如上述（1)~（3)中任一項所述的方法，其特征在于，哺乳動物細胞為 哺乳動物間充質干細胞或哺乳動物T細胞；（5)如上述（4)所述的方法，其特征在于，哺乳 動物間充質干細胞為人骨髓間充質干細胞，哺乳動物T細胞為人末梢血T細胞。
[0022] 本發明還涉及：（6)細胞移植用生理性水溶液，其含有2. 0~6. 0 (w/v) %的海藻糖 或其衍生物或它們的鹽、和4. 0~7. 0(w/v) %的葡聚糖或其衍生物或它們的鹽；（7)如上 述（6)所述的細胞移植用生理性水溶液，其特征在于，生理性水溶液選自由乳酸林格液、生 理鹽水、林格液及乙酸林格液組成的組；（8)如上述（6)或（7)所述的細胞移植用生理性水 溶液，其特征在于，哺乳動物細胞為哺乳動物間充質干細胞或哺乳動物T細胞；(9)如上述 (8)所述的細胞移植用生理性水溶液，其特征在于，哺乳動物間充質干細胞為人骨髓間充質 干細胞，哺乳動物T細胞為人末梢血T細胞。
[0023] 本發明還涉及：（10)含有移植用細胞的生理性水溶液，其含有哺乳動物細胞、和 2. 0~6. 0 (w/v) %的海藻糖或其衍生物或它們的鹽、及4. 0~7. 0 (w/v) %的葡聚糖或其衍 生物或它們的鹽；（11)如上述（10)所述的含有移植用細胞的生理性水溶液，其特征在于， 生理性水溶液選自由乳酸林格液、生理鹽水、林格液及乙酸林格液組成的組；（12)如上述 (10)或（11)所述的含有移植用細胞的生理性水溶液，其特征在于，哺乳動物細胞為哺乳動 物間充質干細胞或哺乳動物T細胞；（13)如上述（12)所述的含有移植用細胞的生理性水 溶液，其特征在于，哺乳動物間充質干細胞為人骨髓間充質干細胞，哺乳動物T細胞為人末 梢血T細胞。
[0024] 作為本發明的其他實施方式，可以舉出：生理性水溶液與海藻糖或其衍生物或它 們的鹽和葡聚糖或其衍生物或它們的鹽的組合用于保存哺乳動物細胞的應用；生理性水溶 液與海藻糖或其衍生物或它們的鹽和葡聚糖或其衍生物或它們的鹽的組合用于制備哺乳 動物細胞的移植用溶液的應用，更詳細而言，上述海藻糖或其衍生物或它們的鹽和葡聚糖 或其衍生物或它們的鹽是抑制細胞存活率降低的有效成分。
[0025] 根據本發明，能夠抑制長期（至少14天）保存含有間充質干細胞等干細胞、T細 胞等白細胞的細胞懸浮液時的細胞存活率的降低，因此，不僅可以將再生醫療、癌癥治療中 的優質移植用細胞懸浮液供往細胞懸浮液的制造地區或其周邊地區，而且也可以將其供往 遙遠地區；另外，醫藥品出貨時的品質保證檢查包括無菌試驗，根據日本藥局方的規定，無 菌檢查需要14天的時間，而根據本發明，即使在上述細胞懸浮液被制造并被實施了上述無 菌檢查之后，也仍能夠提供優質的細胞懸浮液。
【附圖說明】
[0026] 圖1是表示對使用11種哺乳動物細胞移植用溶液（S、LR、"LR+1 % D"、"LR+3% D"、 "LR+5% D"、"LR+7% D"、"LR+3% T"、"LR+3% T+l% D"、"LR+3% T+3% D"、"LR+3% T+5% D"及"LR+3% T+7% D"溶液：參見實施例1的"1-1-1細胞移植用溶液"）將hMSC-BM保存 14天時的細胞存活率進行分析而得的結果的圖。縱軸中，以細胞存活率（％)的形式示出 活細胞相對于總細胞數的比例（平均值土標準偏差，η = 4)。需要說明的是，作為對照示 出保存前的Dulbecco磷酸緩沖鹽水（D-PBS[-])(以下簡稱為"PBS"。）溶液中的細胞存活 率（圖中橫軸的"P"）。
[0027] 圖2是表示對使用11種哺乳動物細胞移植用溶液（S、LR、"LR+1 % D"、"LR+3% D"、 "LR+5% D"、"LR+7% D"、"LR+3% T"、"LR+3% T+l% D"、"LR+3% T+3% D"、"LR+3% T+5% D"及"LR+3% T+7% D"溶液[分別為圖中橫軸的"2~12"]:參見實施例1的"1-1-1細 胞移植用溶液"）將hMSC-BM保存3天、7天及14天時的細胞存活率進行分析而得的結果的 圖。縱軸中，以細胞存活率（％)的形式示出活細胞相對于總細胞數的比例（平均值土標 準偏差，η = 4)。需要說明的是，作為對照示出保存前（0天后）的PBS溶液中的細胞存活 率（圖中橫軸的"1"）。
[0028] 圖3是表示對使用13種哺乳動物細胞移植用溶液（S、LR、"LR+1 % T"、"LR+3% Τ"、 "LR+5% T"、"LR+7% T"、"LR+10% T"、"LR+5% D"、"LR+5% D+l% T"、"LR+5% D+3% T"、 "LR+5% D+5% T"、"LR+5% D+7% T"及"LR+5% D+10% T"溶液：參見實施例 2 的"2-1-1 細 胞移植用溶液"）將hMSC-BM保存14天時的細胞存活率進行分析而得的結果的圖。縱軸中， 以細胞存活率（％)的形式示出活細胞相對于總細胞數的比例（平均值土標準偏差，η = 4)。需要說明的是，作為對照示出保存前的PBS溶液中的細胞存活率（圖中橫軸的"Ρ"）。
[0029] 圖4是表示對使用11種哺乳動物細胞移植用溶液（S、LR、"LR+1 % T"、"LR+3% T"、 "LR+5% T"、"LR+7% T"、"LR+5% D"、"LR+5% D+l% T"、"LR+5% D+3% T"、"LR+5% D+5% T"及"LR+5% D+7% T"溶液[分別為圖中橫軸的"2~12"]:參見實施例2的"2-1-1細 胞移植用溶液"）將hMSC-BM保存3天、7天及14天時的細胞存活率進行分析而得的結果的 圖。縱軸中，以細胞存活率（％)的形式示出活細胞相對于總細胞數的比例（平均值土標 準偏差，η = 4)。需要說明的是，作為對照示出保存前（0天后）的PBS溶液中的細胞存